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DNA實驗技術(shù)：質(zhì)粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是Z常用、Z基本的實驗技術(shù)。
2013-8-6 閱讀(1591)
測定DNA 的核苷酸序列是分析基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提。從小片段重疊法到加減法、雙脫氧鏈終止法、化學降解法、自動測序，DNA 測序技術(shù)發(fā)展很快。目前在實驗室手工測序常用Sanger雙脫氧鏈終止法。Sanger法就是使用DNA 聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA 核苷酸序列的方法。它要求使用一種單鏈的DNA 模板或經(jīng)變性的雙鏈DNA 模板和一種恰當?shù)腄NA 合成引物。其基本原理是DNA 聚合酶利用單鏈的DNA 模板，合成出準確互補鏈，在合成時，某種dNTP換成了ddNTP，這時，DNA 聚合酶利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之摻入到寡核苷酸鏈的3’末端，導致3’末端無3'-OH，從而終止DNA 鏈的生長，雙脫氧核苷酸的種類不同，摻入的位置不同就造成了在不同的專一位置終止的長度不同的互補鏈。通過摻入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可讀出模板DNA 的互補鏈序列。
一、 試劑準備
1. 硅化液：250ml，二氯二甲基硅烷25ml。
2.6%變性PAGE膠的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml攪拌溶解，0.22μm濾膜過濾，4℃貯存于棕色瓶中。使用時取50ml加入催化劑過硫酸銨（25%）50μl，TEMED 50μl，輕搖混勻，立即灌膠。
3.質(zhì)粒DNA 堿變性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），無水乙醇，70%乙醇。
4.T7測序試劑盒。
二、操作步驟
1. 測序板硅化，流水、ddH2O洗，無水乙醇洗，晾干。
2. 灌膠：裝好測序板，玻璃板以15-30°角度傾斜放置，用50ml注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間，將鯊魚齒梳子的平端插入膠的上緣，深約0.5-1cm。夾好，將測序板放水平。聚合約3hr后預(yù)電泳。
3. 預(yù)電泳：按照說明要求安裝好電泳裝置，在上槽和下槽注入1×TBE。設(shè)置溫度50℃，功率100W，時間約30min。
（同時準備測序反應(yīng)）
4. 質(zhì)粒DNA 雙鏈堿變性：DNA 3-5μg溶于32μl ddH2O中，加2N NaOH 8μl，混勻，室溫靜置15min。加3M NaAc 7μl，無水乙醇120μl，混勻，-20℃放置30min。離心12000g× 15min，棄上清，70%乙醇500μl洗一次，離心12000g×7min。棄上清，晾干沉淀，10μl滅菌ddH2O溶解。
5. 模板與引物復性：加2μl測序引物、2μl Annealing buffer， 混勻，稍稍離心，65℃溫育 5min，立即放置于37℃10min，室溫5min以上。
6. 標記反應(yīng)：加 3μl labeling mixture 、1μl相應(yīng)放射性同位素（10μCi）、2μl T7測序酶（使用前以稀釋液1∶5稀釋），混勻，離心，置37℃5min。
7. 預(yù)先準備四個0.5ml微量離心管，標上A、C、G、T，分別在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。
8. 鏈終止反應(yīng)：在A、C、G、T四個微量離心管中分別加入反應(yīng)液4.5μl，37℃ 5min。加入stop solution 5μl，短暫離心。
9. 上樣：關(guān)上預(yù)電泳電源，沖洗膠平面，將鯊魚齒插入膠平面中約1-2mm形成加樣孔。將四個反應(yīng)管置80℃ 2min。立即取1.5-2μl加到加樣孔上。
10．電泳: 50℃，100W，電泳2.5hr后，暫停電泳，在預(yù)留孔二次上樣后，繼續(xù)電泳2.5hr。
11．下膠：停止電泳，取下測序板，倒掉電泳緩沖液。拆開測序板，凝膠應(yīng)粘在未硅化的的玻璃板上。裁一張比膠稍大一些的濾紙，平鋪在膠上，掀起濾紙，凝膠就被一起掀起。
12．壓片：將凝膠蓋上保鮮膜，用monitor測讀放射強度，以估計曝光時間。在暗室中覆上X光片，置暗夾中，-70℃放射自顯影。
13．洗片、讀片：取出暗夾，回到室溫。經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影，水洗，晾干。在X光片燈上讀出序列。
三、注意事項
1. 測序板清洗、硅化的好壞直接影響灌膠及下膠。處理不好時容易導致灌膠時氣泡的產(chǎn)生，下膠時則易使電泳膠損壞。
2. 灌膠時要避免膠的滲漏；注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間時，注意速度的控制，防止氣泡的產(chǎn)生。
3. 測序反應(yīng)及電泳上樣時要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同時要加強整個后續(xù)實驗過程中自身的防護。
4. 規(guī)范、妥善處理放射性同位素接觸物品及廢棄物。
手工測序需要使用同位素，這給操作帶來許多不便，對操作者也有一定的損害。DNA 測序儀的出現(xiàn)解決了這一問題，它不使用同位素標記，自動化程度高，測序效果好。雖然DNA 測序儀的價格目前仍比較高，但每次測序的花費并不算高，而且商品化服務(wù)也令人滿意。
