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一、原理

SNP （Single Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性（Polymorphism）。據(jù)估計(jì)，在人類基因組中，大約每千個(gè)堿基中有一個(gè)SNP，無(wú)論是比較于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析還是微衛(wèi)星標(biāo)記（STR），都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的zui小單位,據(jù)估計(jì)，人類的所有群體中大約存在一千萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)。一般認(rèn)為，相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)稱作單體型（haplotype）。大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個(gè)常見的單體型（每個(gè)具有至少5%的頻率），它們代表了一個(gè)群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。一個(gè)染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn)，但是我們一旦掌握了這個(gè)區(qū)域的單體型，就可以只使用少數(shù)幾個(gè)標(biāo)簽SNPs（tagSNP）來(lái)進(jìn)行基因分型，獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。

二、樣品準(zhǔn)備

1. DNA抽提

①    1、取新鮮肌肉組織約100mg，PBS漂洗干凈，置于1.5ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。

②    加200μl 緩沖液GA，震蕩至*懸浮。加入20μl 蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混勻

③    加220μl 緩沖液GB，充分混勻，37℃消化，溶液變清亮。加220μl 無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

④    將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。

⑤    加入500μl 去蛋白液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。

⑥    加入700μl 漂洗液GW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12000rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液。

⑦    將吸附柱CB 轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，加入100μl 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應(yīng)在60-70℃水浴預(yù)熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液50μl 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。

⑧    采用Beckman DU® 640 spectrophotometer 檢測(cè)提取到的基因組DNA 濃度，在OD260 處有顯著吸收峰。同時(shí)檢測(cè)純度，OD260/280 的值應(yīng)為為1.7-1.9。

⑨    從原液中取出相應(yīng)體積DNA 溶液，稀釋致50ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置于-20℃保存。

2. PCR擴(kuò)增目的片段

按相關(guān)的試劑說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)管中準(zhǔn)備反應(yīng)體系，典型的PCR反應(yīng)體系如下（20ul體系）：

向左扳動(dòng)儀器蓋子上的手柄，揭開儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應(yīng)樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。

3. 在T1型PCR儀上編輯一個(gè)程序

按[C programs]進(jìn)入編輯模式。要在主目錄中創(chuàng)建一個(gè)程序請(qǐng)按[D enter]。要進(jìn)入一個(gè)子目錄，用→鍵將光標(biāo)向右移動(dòng)，然后用↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄。按[D enter]進(jìn)入選擇的子目錄。

輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認(rèn)溫度。為其輸入時(shí)間，用小數(shù)點(diǎn)來(lái)間隔。順序?yàn)閔.m.s。用[D enter]確認(rèn)時(shí)間設(shè)置，或者用光標(biāo)鍵移動(dòng)到下一個(gè)區(qū)域。＃表示循環(huán)的次數(shù)。設(shè)定循環(huán)值=總循環(huán)值-1，即，總循環(huán)數(shù)為30時(shí)應(yīng)輸入“29”。用[C pgm ok]來(lái)儲(chǔ)存一個(gè)完整的程序。程序數(shù)據(jù)*的儲(chǔ)存在記憶中。

4. 運(yùn)行程序

按[B start/stop]選擇一個(gè)程序。用→↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄，或者用[D enter]進(jìn)入主目錄。輸入您想要啟動(dòng)的程序的號(hào)碼。或者，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個(gè)程序。用↑↓鍵在列表中滾動(dòng)選擇。用[D enter]確認(rèn)用強(qiáng)光突出的程序。按[D start]啟動(dòng)程序。

5. 控制測(cè)試過程

運(yùn)行過程中，按A按鈕，可以獲得程序剩余的時(shí)間信息。運(yùn)行完成后，按STOP按鈕終止實(shí)驗(yàn)，按YES確認(rèn)終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實(shí)驗(yàn)樣品，再蓋上蓋子，關(guān)閉電源，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

6. PCR產(chǎn)物測(cè)序

由專門負(fù)責(zé)測(cè)序的服務(wù)公司完成

7. 數(shù)據(jù)分析

少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對(duì)發(fā)現(xiàn)的SNP在基因組中的位置：重點(diǎn)是啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)域（包括編碼區(qū)的cSNP及5’及3’UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導(dǎo)致氨基酸的改變：錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、終止突變。

8. 注意事項(xiàng)

①  為保證待測(cè)目的區(qū)域測(cè)序真實(shí)可靠，引物設(shè)計(jì)應(yīng)該使待測(cè)目的區(qū)域邊界距離上下游引物至少各50bp；

② 引物設(shè)計(jì)建議使用在線方式，以保證成功率；

③ 為保證測(cè)序敏感性，PCR產(chǎn)物片段大小應(yīng)在250bp－650bp范圍；

④ 為方便實(shí)驗(yàn)，建議引物合成時(shí)分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測(cè)序的引物分開；

⑤ 為保證引物的特異性，建議引物設(shè)計(jì)后在NCBI上blast確認(rèn)；

⑥ 為防止降解，PCR產(chǎn)物應(yīng)盡快測(cè)序，否則應(yīng)該保存在-20℃，且時(shí)間不宜過長(zhǎng)；

⑦ 為保證結(jié)果真實(shí)性，建議對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行反向測(cè)序確認(rèn)。