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可在長達3‘的克隆化DN段上產生大量的隨機分布的核苷酸替換突變，在將DNA克隆到一個可用來分離單鏈DNA的載體后，用各種可造成特定堿基損傷的化學試劑處理。
實驗方法
- 基本方案
| 實驗材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 乙酸鈉 亞硝酸鈉 TE 無水乙醇 dNTP 反轉錄酶 RNA酶 洗脫液 溴化乙錠 |
| 儀器、耗材 | 水浴鍋 培養(yǎng)箱 |
| 實驗步驟 | 1. 用限制性內切核酸酶消化DNA以獲得目的DN段，將靶片段雙向克隆到M13噬菌體載體或含有M13復制起始子的質粒載體中。從100 ml 感染細抱培養(yǎng)物中提取單鏈DNA。 2. 在三個微量離心管內各加入40 μg 1 mg/ml 的單鏈DNA，如果靶序列的兩條鏈都要被利用，則需用6個反應。 3. 亞硝酸反應：在一個管內加入10 μl pH4.3的2.5 mol/l 乙酸鈉和50 μl 2 mol/l 亞硝酸鈉，混勻，室溫溫育60 min。 4. 甲酸反應：在另一管內加60 μl 濃甲酸，混勻，室溫溫育10 min。 5. 肼反應：在第三個管內加60 μl 濃肼，混勻，室溫溫育10 min。 6. 毎管加100 μl 2.5 mol/l pH5.5的乙酸鈉，30 μg 擔體tRNA和1 ml 無水乙醇，置干冰中凍至-80℃，放置10 min，離心10 min，去上清，重復乙醇沉淀兩次，再用80 μl TE緩沖液重懸DNA。 7. 在重懸的DNA內加10 μl 4種dNTP混合液，10 μl 10×反轉錄酶緩沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃溫育5 min，再于40℃溫育15 min。 8. 加10 μl 4種dNTP混合液和30~40 U 的AMV反轉錄酶，37℃溫育1 h。 9. 用緩沖液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA，DNA重懸于100 μl 10×限制性內切酶緩沖液，并用適當?shù)南拗菩詢惹忻盖懈?，以便從載體中回收片段。 10. 酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重懸于10~15 μl 洗脫緩沖液，并加0.5 μl 2 mg/ml RNA酶A，37℃溫育15 min 以降解擔體tRNA。 11. 在非變性的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳上，分離從載體上切下的目的片段，凝膠用溴化乙錠染色，切膠，洗脫出DNA。 12. 將純化的插入DNA連接到具有互補末端的質粒或細菌噬菌體載體中。通過常規(guī)的轉化程序將連接混合物導入合適的細菌中 |
