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物種的遺傳多樣性在本質(zhì)上是DNA 一級(jí)序列的多樣性。近年來(lái)，隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展和日益普及，DNA 測(cè)序在遺傳多樣性的研究中正在起著越來(lái)越大的作用。本章將介紹目前在遺傳多樣性研究中常用的一種手動(dòng)和一種全自動(dòng)雙鏈DNA 測(cè)序方法。
1 DNA 模板的制備
在遺傳多樣性的研究中，由于樣本量一般都較龐大，因而DNA 測(cè)序的速度就成了很關(guān)鍵的因素。因此，這類研究中常常直接測(cè)定純化的PCR 雙鏈產(chǎn)物而不大采用克隆技術(shù)。本節(jié)介紹本實(shí)驗(yàn)室常用的從PCR 產(chǎn)物制備測(cè)序模板的方法，即低熔點(diǎn)膠回收法。
（1）制備1.5％～2.0％的瓊脂糖凝膠，待其充分凝固后，在離點(diǎn)樣線5cm 左右處切下寬約1cm 的膠條，在切出的槽中倒入預(yù)先煮沸的低熔點(diǎn)瓊脂糖膠。
（2）低熔點(diǎn)膠凝固后，將待純化的PCR 反應(yīng)液全部點(diǎn)樣，恒壓100V 左右進(jìn)行電泳，直至擴(kuò)增片段進(jìn)入到低熔點(diǎn)膠中部。在360nm 紫外光下，將已進(jìn)入低熔點(diǎn)膠的條帶切下，放入1．5ml離心管中。
（3）離心，將膠塊壓縮到管底，然后補(bǔ)加 TE 至 500μl。于 68℃水浴，將低熔點(diǎn)膠熔化，再迅速加入等體積的水飽和酚并混勻。
（4）室溫下振蕩抽提10 分鐘，再12 000r／min 離心 10 分鐘。取上清液再用氯仿-異戊醇（24:1）抽提5 分鐘。
（5）12 000r／min 離心 10 分鐘，取上清液，在其中加入 1／10 體積的 10 mol／dm3NH4Ac和2 倍體積的無(wú)水乙醇，置―70℃下沉淀半小時(shí)以上。
（6）再12 000r／min 離心 10 分鐘，沉淀用 70％的冷乙醇洗滌；再次短暫離心后小心地倒去乙醇液。沉淀干燥后，加入20～50μlTE 緩沖液或無(wú)菌去離子水中溶解，即為制好的DNA模板。
目前還有一些非常有效的商售試劑盒可用于純化 PCR 產(chǎn)物，如 Oiagen PCR 產(chǎn)物純化試劑盒等，但成本較高。
2 手動(dòng)DNA 序列分析技術(shù)
2.1 測(cè)序膠的制備
按以下配方制備測(cè)序電泳膠：
6％膠工作液 70ml
10％過(guò)硫酸胺（APS） 70μl（新鮮配制）
TEMED 70μl
將上述溶液混合后，灌入準(zhǔn)備好的膠板中，將“鯊魚(yú)齒”梳子反插入膠，深約0.5～1.0cm。室溫下聚合1 小時(shí)左右。
2.2 測(cè)序反應(yīng)
測(cè)序試劑盒購(gòu)自美國(guó) USB 公司，測(cè)序酶為 Sequenase Version 2.0；α35S-dATP 購(gòu)自美國(guó)
DuPont 公司（1mCui／100μl）。測(cè)序反應(yīng)按USB 推薦的方法進(jìn)行：
（1）DNA 模板混合液（0．5ml Eppendorf 管）：
DNA 模板 7μl
測(cè)序引物 1μl
5 倍 Reaction buffer 2μl
NP4O 1μl
（2）標(biāo)記混合液（每一反應(yīng)的量）：
DTT（0.1mol／dm3） 1μl
1／5dGTP labelling mix 2μl
Enzyme dilution buffer 1.75μl
NP4O 0.55μl
去離子水 0.375μl
測(cè)序酶 0.125μl
35S-dATP 0.5μl
（3）ddNTP（ddA、ddG、ddC、ddT） 2.5μl
（4）退火反應(yīng)（annealing）：將DNA 模板混合液煮沸3 分鐘，迅速放入乙醇和干冰的混合冰浴箱中退火30 秒左右（如無(wú)干冰，則用冷凍于－20℃～－70℃下的無(wú)水乙醇，臨用前由冰箱中取出）。在進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)之前，反應(yīng)液需保存于干冰或碎冰中。
（5）標(biāo)記反應(yīng)（labelling）：由干冰或冰中取出經(jīng)退火的DNA 模板混合液，放在手中使其融化，然后加入 5.5μl 的標(biāo)記混合液。在微型離心機(jī)上離心 10～15 秒后，置室溫中 1 分鐘。（6）鏈終止反（termination）：將上一步驟制成的混合液以每管3.3μl 分裝入預(yù)先在37℃下溫浴的加有ddNTP 的管中，并在37℃下反應(yīng)4～5 分鐘。
（7）每管加入4μl 終止液（stop solution）。
2.3 電泳
電極緩沖液 1 倍TBE（pH 值8.0）
預(yù)電泳 30 分鐘至1 小時(shí)
恒溫方式 測(cè)序膠板上夾蓋鋁恒溫板
電泳溫度 50℃左右
電泳條件 恒功率 90～110W
電泳時(shí)間 2.5 小時(shí)至5 小時(shí)
2.4 干膠制備和壓片
電泳結(jié)束后取下膠板，用工具撬開(kāi)玻璃板，使膠留在其中一塊板上。將裁剪好的新華3 號(hào)濾紙?jiān)谀z上貼緊，使膠粘在濾紙上，然后將膠放置于干膠器中制備干膠1～1.5 小時(shí)。制好的干膠放入壓片盒中，放于暗室中，將X 光片壓于膠上曝光2～3 天。
2.5 X 光片的沖洗
將曝光后的X 光片顯影4～8 分鐘（根據(jù)顯影液的使用時(shí)間長(zhǎng)短而定）；定影5～10 分鐘，沖洗后即可讀取DNA 序列。
3 自動(dòng) DNA 序列分析技術(shù)
本節(jié)描述運(yùn)用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自動(dòng)DNA 測(cè)序儀進(jìn)行雙鏈DNA 測(cè)序的方法。熱循環(huán)測(cè)序反應(yīng)使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit（＃401434）或FS-DNA Sequencing Kit（＃402079）進(jìn)行。操作過(guò)程主要根據(jù)廠家推薦的方法進(jìn)行。具體操作方法如下。
3.1 混合反應(yīng)物
（1）取2.5μl 純化好的PCR 產(chǎn)物［相對(duì)于2.5μl 測(cè)序試劑盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
（2）凝膠用溴化乙錠染色，用流水沖洗脫色后，在紫外光下進(jìn)行照相記錄。參照pGEM-3Zf
（十）DNA 估測(cè)待測(cè)DNA 模板的濃度，以確定測(cè)序反應(yīng)中應(yīng)取的模板量。
（3）在一個(gè)標(biāo)記的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反應(yīng)物：
DNA 模板 適量
引物（10pmol／ml） 0.5μl
加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit）
100℃下變性2 分鐘，再冰浴2 分鐘后短暫離心，然后加：
DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中測(cè)序液 4.75μl
或 FS-DNA Sequencing Kit 中測(cè)序液 4.0μl
終體積 10μl
（4）用微量取樣器將反應(yīng)物充分混合后，加 20μl 石蠟油覆蓋。
3.2 熱循環(huán)反應(yīng)
該反應(yīng)中降溫時(shí)間非常關(guān)鍵（約1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的熱循環(huán)儀（PCR 儀，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 熱循環(huán)儀。將反應(yīng)管放入熱循環(huán)儀中，按以下程序進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)：
（1）96℃ 1 秒鐘
96℃ 30 秒鐘
（2）50℃ 1 秒鐘
50℃ 1 分鐘
（3）60℃ l 秒鐘
60℃ 4 分鐘
共需25 個(gè)循環(huán)。
3.3 純化測(cè)序產(chǎn)物
純化測(cè)序產(chǎn)物的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃CS-901）。操作過(guò)程如下：
（1）輕彈柱，使Cephadex G-50 膠粉從柱底部揚(yáng)起。
（2）移去柱上蓋，加入 800μl 去離子水，再蓋上蓋振蕩，以除去氣泡。
（3）在室溫下放置30 分鐘，以水化凝膠柱。
（4）移去柱上蓋和下蓋，將凝膠柱放入一個(gè)配置好的洗脫管中，讓多余液體流出。
（5）倒去液體，將柱連同洗脫管一起在 3 000r／min 下離心 2 分鐘。
（6）將柱放入一個(gè)1.5ml 離心管中，用微量取樣器將測(cè)序反應(yīng)物取出，注在凝膠柱中央。注意避免帶入石蠟油。
（7）3 000r／min 下離心 2 分鐘。應(yīng)注意柱的定向必須與*次離心時(shí)一致。
（8）將樣品放在真空干燥離心機(jī)中干燥。
（9）將干燥后的樣品貯存于―70℃下待進(jìn)行電泳。在此條件下保存1 年之久的樣品其熒光也不會(huì)猝滅。
應(yīng)注意的是，Centri-sep 柱體可反復(fù)使用多次。每次使用過(guò)后，要用自來(lái)水洗3 次，蒸餾水洗 2 次，然后倒置于一試管架上晾干后，稱取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。
3.4 電泳
使用ABI 公司的377 型全自動(dòng)DNA 序列分析儀電泳，并記錄序列數(shù)據(jù)?？刂栖浖镻RIM377 Collection。電泳過(guò)程如下。
（1）聚丙烯酚胺凝膠濃度為4.25％，配制過(guò)程如下：
尿素 18g
Amberlite 離子交換樹(shù)脂（Sigma，MB-lA） 約39g
40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml
去離子水 25ml
將混合液在電磁攪拌器上攪拌10 分鐘。
（2）取5ml 10 倍TBE，通過(guò)2μm 濾膜抽濾后，再抽濾以上膠液。
10 倍TBE 配方：
Tris-base 108g
硼酸 55g
Na2 EDTA（2H2O） 7.44g
定容至 1L
（3）將濾過(guò)液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％過(guò)硫酸胺（APS），輕搖混合后，用50ml 無(wú)針頭注射器將膠注入已裝配好的玻璃板中。
（4）1 小時(shí)后，將膠安裝于全自動(dòng)序列儀上預(yù)電泳 30 分鐘，恒壓1kv，并使溫度升至 51℃。
（5）預(yù)電泳的同時(shí)，取出 36 份―70℃下貯存的樣品，各加入5μl 載樣液（50μl 試劑盒中配備的loading buffer＋250μl 去離子甲酰胺，臨用前配制）。
（6）將混合液在旋渦混合器上振蕩，94℃下變性2 分鐘，冰浴2 分鐘后短暫離心。
（7）各取 1.5μl 點(diǎn)樣，恒壓 1.68kv 電泳 7 小時(shí)。機(jī)器將自動(dòng)分析和記錄序列結(jié)果。常有電泳道識(shí)別錯(cuò)誤的情況，此時(shí)應(yīng)人為修復(fù)。
來(lái)源：儀器交易網(wǎng) http://www.yi7.com/com_beinuo/news/itemid-33578.html