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08

2013年
01月

膠體金免疫金銀組織化學(xué)技術(shù)

①膠體金溶液可以重復(fù)制備,其顆粒大小可以控制,可較容易進(jìn)行免疫電鏡的雙重或多重標(biāo)記;②金標(biāo)探針有很高的電子密度,有特殊的分辨率,定位準(zhǔn)確;③金標(biāo)探針能發(fā)射二次電子和反射電子,是掃描電鏡目前的標(biāo)記物;④金標(biāo)探針與組織細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合后,可用銀增強(qiáng),大大提高了IHC的敏感性,是目前zui為敏感的IHC方法之一;⑤免疫金銀染色方法無(wú)致癌性,使用較安全。膠體金技術(shù)是以膠體金作為一種標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠,它具有一般溶膠的特性。溶膠是指一種物質(zhì)以或大或小的微小粒子分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系。被分
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08

2013年
01月

膠體金的一般性狀

(一)膠體金的顏色溶膠的顏色取決于分散相物質(zhì)的顏色、分散相物質(zhì)的分散度和入射光線的種類(lèi),是散射光線還是透射光,粒子越小,分散度越高,則散射光的波長(zhǎng)越短。對(duì)同一種物質(zhì)的水溶膠來(lái)說(shuō),粒子大小不同,呈現(xiàn)的顏色亦不同。如膠體金顆粒在5~20nm之間,吸收波長(zhǎng)520nm,呈紅色的葡萄酒色;20~40nm之間的金溶膠主要吸收波長(zhǎng)530nm的綠色光,溶液呈深紅色;60nm的膠體金溶膠主要吸收波長(zhǎng)600nm的橙黃色光,溶液呈藍(lán)紫色。一般應(yīng)用于免疫組織化學(xué)的膠體金顆粒為5~60nm范圍內(nèi),溶液呈現(xiàn)紅色。在相當(dāng)?shù)囊?/div> 【查看全文】
06

2013年
01月

大規(guī)模連接及純化連接后的DNA

[方法]1.建立以下連接反應(yīng):●載體DNA(pG6AppG6B,pG6C)(10ug)xul●cDNA片段(3~5ug)yul●10×連接緩沖液40ul●T4DNA連接酶(6WeissU/ul)5ul●水400ul2.在16℃過(guò)夜孵育。3.在70℃孵育30分鐘,使T4DNA連接酶變性。4.加1體積的乙醇并振蕩45秒,在14000g微離心機(jī)中離心10分鐘,然后將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的微離心管中。5.加1體積的24/1(體積比)氯仿/異戊醇并振蕩45秒,在14000g微離心機(jī)中離心5分鐘,然后將上清液
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06

2013年
01月

Topl0F’細(xì)胞中的電轉(zhuǎn)化及文庫(kù)儲(chǔ)存

[方法]1.加2~3ul純化的連接反應(yīng)物(zui大值為0.3ugDNA)到80ul的*0F’電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中,輕輕搖晃混合。使用30ng(2ul)的pUCl9控制電轉(zhuǎn)化效率。2.將細(xì)胞+DNA懸浮液轉(zhuǎn)移到已冷卻的0.2cm細(xì)胞電轉(zhuǎn)化管,并冰浴3分鐘。3,將GenePulserPlus電穿孔儀設(shè)置為2.5kV脈沖,電容器設(shè)為25uF,脈沖控制器設(shè)為200ns。4.用紙巾干燥電轉(zhuǎn)化管,然后將它放在電轉(zhuǎn)化箱中,使用一個(gè)脈沖(寄存時(shí)間常量必須為4.5~5.0毫秒)。5.立即加lmlLB到電擊管中,打散
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04

2013年
01月

gⅥ-cDNA噬菌粒文庫(kù)小規(guī)模的獲取和純化

[方法]1.將克隆體接種到100ulLBAT96孔培養(yǎng)板上,并在37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)(180r/min)。2.使用96孔復(fù)制板將其接種到裝有200ulLBAT的第二塊96孔培養(yǎng)板上,在37℃培養(yǎng)直到生長(zhǎng)中期(大約1,5小時(shí))。3.在每一孔中加入10ul2×1011TU/mlR408輔助噬菌體。4.37℃無(wú)振蕩培養(yǎng)30分鐘。5.37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。6.4℃800g離心20分鐘,收集細(xì)胞。7.將上清液轉(zhuǎn)移到一新的96孔培養(yǎng)板上,并加40pulPEG/NaCl。8.將板放置于冰上1小時(shí)。9.4℃800g
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04

2013年
01月

gⅥ-cDNA融合噬菌體ELISA

[方法]1.用200ulPBST沖洗鏈霉素包被的微量濃度測(cè)定板的每個(gè)孔3次。2.在2mol/LPBS中稀釋生物素配體(BAS噬菌體—ELISA)或生物素捕獲抗體(ISA噬菌體—ELISA),直到終濃度為10—50nmol/l,再加100ul這種溶液到農(nóng)度測(cè)定板中的每個(gè)孔中。3.在室溫下孵育濃度測(cè)定板1小時(shí)。4。用200ulPBST沖洗每個(gè)孔5次。5.在2mol/LPBS中稀釋噬菌體溶液到濃度為1×1011TU/ml,在*次用來(lái)稀釋IAS融合噬菌體的2mol/LPBS中加入誘餌血清或預(yù)免疫血清,再
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29

2012年
12月

用scFv接頭PCR裝配VH和VL進(jìn)行scFv基因文庫(kù)的構(gòu)建

[方法]1.在0.5ml微量離心管內(nèi)配制以下PCR反應(yīng)混合液。配制成2個(gè)“反應(yīng)管”,1個(gè)含有V。文庫(kù)DNA,另1個(gè)則含有Vl文庫(kù)DNA。反應(yīng)管對(duì)照1對(duì)照2●scFV接頭DNA(100ng/ul)1.0ul1.0ul●VH文庫(kù)DNA(100ng/ul)3.5ul1.0ul●V-文庫(kù)DNA(Vκ或Vλ)(100ng/ul)3.0ul1.0ul●水6.5ul5.5ul2.在每管中加入:●水,33ul●10×Vent緩沖液,5.0ul●20×dNTP,2.5ul3.在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃,5分
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29

2012年
12月

再擴(kuò)增scFv基因文庫(kù)以添加限制性位點(diǎn)進(jìn)行克隆

[方法]1.在0.5ml微量離心管中,配制兩個(gè)50/z1PCR反應(yīng)混合液(1個(gè)用于VH—VκscFv文庫(kù),另1個(gè)用于Vu—VλscFv文庫(kù)),其中含有:●水,36.5//1●10XTag緩沖液,5.0ul●20XdNTP,2.5ul●正向引物,2.0ul●反向引物,2.0ul●scFv基因文庫(kù)(約long),1.0ul2.在熱循環(huán)儀格內(nèi)加熱反應(yīng)管到94℃,5分鐘。如果沒(méi)有加熱蓋,則滴加1滴輕質(zhì)礦物油覆蓋反應(yīng)液。3.加入1.0ul(5單位)TdQDNA聚合酶。4.以94℃1分鐘、55℃1分鐘、72
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