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29
2012年
12月 -
[方法]1，配制兩個100ulPCR反應(yīng)混合液來消化scFV文庫，其中1個用于VH-VκscFv文庫，另1個用于VH-VλscFv文庫，該混合液含有：●scFVDNA（1～4ug），50ul●水，33ul●10×NEB3緩沖液，10ul●乙酰BSA（100×），1．0ul●Nco工（10U/ul），3．0f11●NoJ工（10U/ul），3．0ul2．37℃孵育反應(yīng)液過夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置，防止水分蒸發(fā)?；蛘?，可以按PCR反應(yīng)那樣加一層礦物油（Sigma）。3．用1%瓊脂糖【查看全文】
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27
2012年
12月 -
[方法]1．將電轉(zhuǎn)化儀設(shè)置為200D（電阻）、25rtF（電容）和2．5kV。2．在冰上復(fù)溶電感受態(tài)細(xì)菌或使用新鮮制備的電感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)化杯、杯固定夾、細(xì)胞和DNA均放于冰上。3．將80ng已純化且無鹽的DNA與50g1細(xì)菌混合。冰上孵育混合物1分鐘。4．將混合物轉(zhuǎn)移至0．2cm間距的電轉(zhuǎn)化杯中，小心操作切勿在電極間留氣泡。輕拍小杯，使所有液體均沉淀于瓶底。迅速轉(zhuǎn)移以使小杯處于低溫狀態(tài)。5．將透明杯放入電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，確保小杯側(cè)面干燥（以免電?。用}沖，立即加入1．0mlSOC培養(yǎng)基并混合。【查看全文】
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27
2012年
12月 -
抗體文庫儲存料中制備噬菌體。在開始實驗之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀釋鋪板）計算每毫升抗體文庫儲存料中細(xì)菌的數(shù)目。在600nm（A600）處的某個特定吸光值下，抗體文庫中細(xì)菌數(shù)目較未感染細(xì)菌數(shù)目低一些。這或許是因為含有質(zhì)粒的文庫細(xì)菌體積更大，或者是存在死細(xì)菌。一旦滴度與A600確定關(guān)系，吸光值即可用于細(xì)菌數(shù)目的計算。對于噬菌體的制備（文庫救援），來自文庫儲存料的起始接種量應(yīng)比文庫容量大5倍。接種到培養(yǎng)基后，細(xì)菌濃度的A600不應(yīng)超過0．05。采用文庫容量5倍以上的細(xì)菌接種【查看全文】
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25
2012年
12月 -
1．在每毫升zui后的噬菌體懸液（例如來自實驗方案13．11）中，加入0．45g氯化銫，充分混勻至溶解。2．用吊桶式轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)男吞枺╇x心溶液，15℃17h，噬菌體將濃縮在組分1和組分2中（。組分1的濃度較高，但組分2的體積較大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取這些組分。如果是*次使用本實驗方案，那么先收集所有條帶并分別對其檢測將是明智之舉。3．將收獲的溶液對PBS透析過夜。4．通過感染大腸桿菌DH5cF，或TGl滴定各個不同組分中噬菌體，并保存滴度zui高的組分。通常，噬菌體會集中在1個區(qū)帶內(nèi)【查看全文】
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25
2012年
12月 -
從噬菌體抗體文庫中分離抗原特異性抗體，是通過讓噬菌體進(jìn)入到在抗原上進(jìn)行的重復(fù)性選擇循環(huán)來實現(xiàn)的。理想情況下，僅需l輪選擇即可完成。但事實是，絲狀噬菌體常常非特異性地結(jié)合到支持物表面，從而限制了每輪所能獲得的富集水平。實際上，需要2～5輪的選擇。現(xiàn)在已設(shè)計了許多各自不同的選擇方法；其中包括在固相支持物上包被抗原進(jìn)行生物淘選，使用免疫親和層析注或BIAcore傳感芯片，用生物素化抗原選擇E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳動物E403細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞E41-433、新鮮細(xì)胞上進(jìn)行【查看全文】
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2012年
12月 -
在微量滴定板中進(jìn)行可溶性SCFv ElISA的方法
1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃過夜。PBS中10ug／m1的濃度是包被抗原的標(biāo)準(zhǔn)濃度。但有時需要更高的濃度或者不同的包被緩沖液（比如碳酸鹽緩沖液）。2．棄去抗原液并用PBS洗滌板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封閉每個板孔，37℃孵育2小時。4．用PBS洗滌板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗體的培養(yǎng)基上清，用移液器反復(fù)吹吸混勻，室溫孵育1小時。7．棄去溶液，用PBS／Tween洗滌板孔3次，再用PBS洗滌3次。8．每孔加入100【查看全文】
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22
2012年
12月 -
噬菌體展示可使抗體親和力提高到1000倍以上。很典型的起始點是自噬菌體抗體文庫中分離特異性抗體。為完成親和力的成熟（親和力的增加），要對抗體序列進(jìn)行多樣化；突變基因文庫展示在絲狀噬菌體表面上，并在抗原上選擇具有更高親和力的結(jié)合性抗體。盡管整個過程已相當(dāng)清晰，但研究者在進(jìn)行體外親和力成熟前必須明確：提高特定抗體親和力將會產(chǎn)生預(yù)期的生物學(xué)效果。當(dāng)嘗試用抗體中和循環(huán)中的毒素或生長因子時，更高的親和力就顯得特別重要。在此情況下，抗體與抗原都分布于同樣的區(qū)域，能使抗原抗體的相互作用達(dá)到平衡狀態(tài)。親和力越高【查看全文】
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20
2012年
12月 -
利用含有目標(biāo)受體的復(fù)雜混合物，對噬菌體展示肽文庫進(jìn)行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細(xì)胞或組織表面等。在此情況下，目標(biāo)就是要鑒定出結(jié)合于特定受體分子或結(jié)合于一組具有特定性質(zhì)的受體上的多肽。我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關(guān)的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結(jié)合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關(guān)抗體的相應(yīng)配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來自HCV感染者和非感染者的血清（以下分別稱為陽性血清和陰【查看全文】
