全柱成像毛細(xì)管等電聚焦——高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（iCIEF-MS）分析重組人單克隆抗體

張曉夕

全柱成像毛細(xì)管等電聚焦（imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF）是一種基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（isoelectric point, pI）將其分離的技術(shù)，在生物制藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用于電荷變異體的分析。

與傳統(tǒng)的毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）技術(shù)相比，iCIEF具有方法開發(fā)更快（每個(gè)樣品僅需10~15min），靈敏度更高，pI值相近的電荷變異體分離更好（分離精度0.01pI），儀器平臺(tái)穩(wěn)定性好以及高分析通量等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 iCIEF分離及UV檢測(cè)原理

雖然iCIEF平臺(tái)可以將常見的生物治療產(chǎn)品，如單抗、融合蛋白等按照其等電點(diǎn)進(jìn)行分離，但受其檢測(cè)手段的局限性，無(wú)法得到更為全面深入的蛋白表征信息。2021年6月，賽默飛世爾科技宣布了與Advanced Electrophoresis Solutions Ltd（AES）的合作， 通過(guò)將AES的CEInfinite iCIEF平臺(tái)與賽默飛的高分辨質(zhì)譜平臺(tái)聯(lián)用，對(duì)iCIEF分離的電荷變異體進(jìn)行表征，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物治療產(chǎn)品更加深入的理解。

圖2 CEInfinite iCIEF平臺(tái)

今年9月，來(lái)自丹麥Symphogen 的首席科學(xué)家Dan Bach Kristensen在CE Pharm 2021會(huì)議上以視頻形式介紹了iCIEF-MS聯(lián)用的最新成果。Dan在報(bào)告中提到，使用質(zhì)譜對(duì)單克隆抗體進(jìn)行分子量分析，樣品前處理步驟簡(jiǎn)單，且Orbitrap高分辨質(zhì)譜平臺(tái)的高分辨率和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)可以提供足夠多的信息，幫助科研人員從完整分子量層面對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)控。

通過(guò)將不同原理的液相分離技術(shù)，如SEC/CIEX/Protein A/RPLC分別與質(zhì)譜串聯(lián)，可以將單克隆抗體的不同類型變異體進(jìn)行分離，隨后得到各個(gè)變異體的分子量信息。

Dan在他的演講中舉了一個(gè)使用iCIEF-MS聯(lián)用對(duì)參比品（-80℃保存）和實(shí)驗(yàn)品（48個(gè)月，5℃保存）進(jìn)行對(duì)比的示例。通過(guò)觀察iCIEF-UV圖譜，發(fā)現(xiàn)相較于參比品，實(shí)驗(yàn)品的酸/堿峰均有一定比例的上升。進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)確認(rèn)導(dǎo)致酸/堿峰比例增加的具體修飾類型，發(fā)現(xiàn)對(duì)于堿峰，Orbitrap高分辨質(zhì)譜的高分辨率和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)可以最大限度的減少相鄰質(zhì)譜峰的重疊，從而提供更加可信的鑒定結(jié)果。最終，通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定的完整分子量結(jié)果，可以得出的結(jié)論是實(shí)驗(yàn)品中與穩(wěn)定性相關(guān)的產(chǎn)品屬性含量上升，而與質(zhì)量相關(guān)的產(chǎn)品屬性變化不大-這與科研人員的預(yù)期相符。