ToloScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶

是將 PCR 反應(yīng)用到的超保真 P6 DNA 聚合酶、buffer、dNTP Mixture 以及穩(wěn)定劑以 2倍的終濃度進行混合。使用時，只需在制品溶液中加入模板和引物便可進行 PCR反應(yīng)，大大簡化了操作過程，降低了 PCR操作過程中污染的可能性。P6 High-Fidelity DNA Polymerase 是基于 Pyrococcus furiosus 的高溫 DNA聚合酶，具有耐熱型 5´-3´ 的聚合酶活力以及 3´-5´的核酸外切酶活力，因此屬于高保真 DNA 聚合酶（其保真度達到普通 Taq 酶的 55 倍）。該酶經(jīng)過生物工程改造后，其擴增能力、保真度都得到提升，并且具有廣泛的模板適應(yīng)性，擴增速度達到 2-4 kb/min。優(yōu)化的 Premix 針對 λ DNA 等簡單模板的有效擴增長度可達 40 kb，cDNA 有效擴增長度可達 15 kb，基因組有效擴增長度可達 20 kb。

ToloScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶

無染料 

2×P6 High-Fidelity Premix 

Loading buffer 

預(yù)混液應(yīng)置于-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

（1）性能檢測 1：

在 50 μL PCR 反應(yīng)體系加入 25 μL premix、100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 質(zhì)粒，擴增 15 kb 的 DNA目的片段，在 30 個循環(huán)擴增后經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠檢測可在 15 kb 處檢測到非常亮且單一的目的條帶。

（2）性能檢測 2：

在 50 μL PCR 反應(yīng)體系加入 25 μL premix、大腸桿菌菌落，擴增 5 kb 的 DNA 目的片段，在 30 個循環(huán)擴增后經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠檢測可在 5 kb 處檢測到較亮的單一目的條帶。

（3）大腸桿菌核酸殘留檢測：

在 20 μL 熒光定量 PCR 反應(yīng)體系加入 10 μL premix（無染料）和大腸桿菌特異基因擴增引物（如 gapA）；

在不加入大腸桿菌 DNA 模板的情況下，20 個循環(huán)內(nèi)熒光信號值在基線范圍。

ToloScript Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶

* 針對不同類型的模板，所需的模板量會有不同，如基因組和質(zhì)粒，等等；需要根據(jù)實際情況，添加合適的模板量。

** 退火溫度需根據(jù)引

物和模板實際的 G+C 含量來作調(diào)整。 mix

2. PCR 反應(yīng)參數(shù)（供參考）**：

(起始變性): 95 ℃ 5 min

(解鏈): 95 ℃ 30 sec

(退火): 55 ℃ 30 sec

(延伸): 72 ℃ x min （30-35 循環(huán)：2 kb/min）

(終延伸): 72 ℃ 7 min

(臨時保存): 16 ℃ 保溫

1. 在冰浴上設(shè)置 PCR 反應(yīng)（供參考）*：

模板: < 500 ng

2× P6 High-Fidelity Premix: 25 μL

Primer 1/2: 0.2 - 1.0 μM (final conc.)

滅菌蒸餾水 Up to 50 μL

2× P6 High-Fidelity Premix 高保真酶?應(yīng)用實例

P6 擴增速度測試

以pUC18質(zhì)粒為模板擴增不同長度的DNA的片段，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

常規(guī) PCR 擴增指南：

1. 簡單模板如質(zhì)粒等可按照 5 sec/kb 設(shè)置程序。

2. 大多數(shù)模板的預(yù)變性溫度為 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板預(yù)變性溫度為 98 度，30 sec-5 min。

3. 常規(guī)退火時間設(shè)置為 10 sec，復(fù)雜模板設(shè)置為 10 sec-30 sec。

P6 擴增不同長度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 質(zhì)粒為模板擴增不同長度的 DNA的片段，PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

長片段擴增指南：

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 增加引物長度提高退火溫度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加適當(dāng)濃度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高變性溫度為 98 度，縮短變性時間為 5 sec。

P6 擴增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因組為模板擴增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序設(shè)置為：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

高 GC 和低 GC 模板擴增指南

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 高 GC 模板可適當(dāng)添加 DMSO，一般終濃度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可適當(dāng)提高退火溫度，還可使用 Touch down 的方法進行 PCR 擴增。

4. 低 GC 含量模板可以適當(dāng)降低退火溫度。 

以pUC18質(zhì)粒為模板擴增不同長度的DNA的片段，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

常規(guī) PCR 擴增指南：

1. 簡單模板如質(zhì)粒等可按照 5 sec/kb 設(shè)置程序。

2. 大多數(shù)模板的預(yù)變性溫度為 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板預(yù)變性溫度為 98 度，30 sec-5 min。

3. 常規(guī)退火時間設(shè)置為 10 sec，復(fù)雜模板設(shè)置為 10 sec-30 sec。

P6 擴增不同長度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 質(zhì)粒為模板擴增不同長度的 DNA的片段，PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

長片段擴增指南：

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 增加引物長度提高退火溫度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加適當(dāng)濃度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高變性溫度為 98 度，縮短變性時間為 5 sec。

P6 擴增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因組為模板擴增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序設(shè)置為：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

高 GC 和低 GC 模板擴增指南

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 高 GC 模板可適當(dāng)添加 DMSO，一般終濃度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可適當(dāng)提高退火溫度，還可使用 Touch down 的方法進行 PCR 擴增。

4. 低 GC 含量模板可以適當(dāng)降低退火溫度。 

以pUC18質(zhì)粒為模板擴增不同長度的DNA的片段，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

常規(guī) PCR 擴增指南：

1. 簡單模板如質(zhì)粒等可按照 5 sec/kb 設(shè)置程序。

2. 大多數(shù)模板的預(yù)變性溫度為 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板預(yù)變性溫度為 98 度，30 sec-5 min。

3. 常規(guī)退火時間設(shè)置為 10 sec，復(fù)雜模板設(shè)置為 10 sec-30 sec。

P6 擴增不同長度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 質(zhì)粒為模板擴增不同長度的 DNA的片段，PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

長片段擴增指南：

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 增加引物長度提高退火溫度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加適當(dāng)濃度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高變性溫度為 98 度，縮短變性時間為 5 sec。

P6 擴增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因組為模板擴增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序設(shè)置為：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

高 GC 和低 GC 模板擴增指南

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 高 GC 模板可適當(dāng)添加 DMSO，一般終濃度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可適當(dāng)提高退火溫度，還可使用 Touch down 的方法進行 PCR 擴增。

4. 低 GC 含量模板可以適當(dāng)降低退火溫度。 

以pUC18質(zhì)粒為模板擴增不同長度的DNA的片段，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃ 5min；98℃ 5sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1sec；72℃ 5min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

常規(guī) PCR 擴增指南：

1. 簡單模板如質(zhì)粒等可按照 5 sec/kb 設(shè)置程序。

2. 大多數(shù)模板的預(yù)變性溫度為 95 度，30 sec-5 min。

高 GC 含量模板預(yù)變性溫度為 98 度，30 sec-5 min。

3. 常規(guī)退火時間設(shè)置為 10 sec，復(fù)雜模板設(shè)置為 10 sec-30 sec。

P6 擴增不同長度的 DNA的片段

以 100 ng Human RP11 13M9-pBACe3.6 質(zhì)粒為模板擴增不同長度的 DNA的片段，PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為： 95 ℃ 5min；98 ℃ 5 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 8 min；72 ℃ 10 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

長片段擴增指南：

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 增加引物長度提高退火溫度，退火/延伸合并成一步。

3. 添加適當(dāng)濃度的 DMSO，一般不高于 5%。

4. 提高變性溫度為 98 度，縮短變性時間為 5 sec。

P6 擴增高 GC 含量和低 GC 含量 DNA的片段。

以人基因組為模板擴增不同 GC 含量的 DNA的片段，程序設(shè)置為：95 ℃ 5min；95 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec, 72 ℃ 1 sec；72 ℃ 5 min(30 Cycles)。結(jié)果如下：

高 GC 和低 GC 模板擴增指南

1. 使用高質(zhì)量的模板。

2. 高 GC 模板可適當(dāng)添加 DMSO，一般終濃度不高于 5%。

3. 高 GC 含量模板可適當(dāng)提高退火溫度，還可使用 Touch down 的方法進行 PCR 擴增。

4. 低 GC 含量模板可以適當(dāng)降低退火溫度。