H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒
本試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區(qū)作為擴(kuò)增靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物探針，通過(guò)一步法實(shí)時(shí)熒光PCR體系擴(kuò)增對(duì)H7N9禽流感病毒進(jìn)行定性檢測(cè)。

H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒

廣州創(chuàng)侖生物制品有限公司

 
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區(qū)作為擴(kuò)增靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物探針，通過(guò)一步法實(shí)時(shí)熒光PCR體系擴(kuò)增對(duì)H7N9禽流感病毒進(jìn)行定性檢測(cè)。反應(yīng)體系中除特異性引物和特異性熒光探針外，還配以對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)Buffer、逆轉(zhuǎn)錄酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸單體（dNTPs）、Mg2+等成分，可實(shí)現(xiàn)對(duì)H7N9禽流感病毒核酸靈敏特異地檢測(cè)。
【主要組成成分】

H7N9禽流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒

【儲(chǔ)存條件及有效期】保存于-20±5℃，反復(fù)凍融次數(shù)＜5次，有效期9個(gè)月。

【適用儀器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等熒光定量PCR儀。

【樣本要求】
1 適用樣本類型：呼吸道樣本、血清、肺組織。
2 樣品采集、保存與運(yùn)送。
標(biāo)本采集、保存、運(yùn)送請(qǐng)遵循《人感染H7N9禽流感病毒標(biāo)本采集及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)策略》。

【檢驗(yàn)方法】
1.核酸提取
建議取200µl液態(tài)樣本進(jìn)行核酸提??；組織樣本可以研磨液進(jìn)行提取操作?？刹捎弥猩酱髮W(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒，請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；也可選擇其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品。本試劑盒中的內(nèi)標(biāo)溶液參與提取過(guò)程，若提取試劑盒中未說(shuō)明內(nèi)標(biāo)的使用方法可在每200µl樣本中加入4µl內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)行核酸提取。
本試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控；AIV H7N9陽(yáng)性質(zhì)控品不參與提取，用于PCR檢測(cè)試劑的質(zhì)控。
2.PCR擴(kuò)增（ABI 7500儀器操作為例，ABI 7300、LC480等儀器參照此操作及儀器操作手冊(cè)）
2.1分別配制AIV H7 RT-PCR反應(yīng)體系和AIV N9 RT-PCR反應(yīng)體系
2.1.1 AIV H7 RT-PCR反應(yīng)體系配制
取適量PCR反應(yīng)管（按AIV H7反應(yīng)體系計(jì)算）；每管加入AIV H7 PCR反應(yīng)液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應(yīng)液B 3µl（也可按照單個(gè)反應(yīng)的用量，計(jì)算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個(gè)PCR反應(yīng)管中）。
2.1.2 AIV N9 RT-PCR反應(yīng)體系配制
取適量PCR反應(yīng)管（按AIV N9反應(yīng)體系計(jì)算）；每管加入AIV N9 PCR反應(yīng)液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應(yīng)液B 3µl（也可按照單個(gè)反應(yīng)的用量，計(jì)算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個(gè)PCR反應(yīng)管中）。
2.2 于上述PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、AIV H7N9陽(yáng)性質(zhì)控品、待測(cè)標(biāo)本核酸各5µl，8,000rpm離心數(shù)秒，放入PCR擴(kuò)增儀。
2.3探針檢測(cè)模式設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反應(yīng)條件設(shè)置為：50℃ 15min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集熒光），45個(gè)循環(huán)。保存文件，運(yùn)行。
3.結(jié)果分析
3.1 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。 
3.2 分析條件設(shè)置：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在3～15、End值可設(shè)在5～20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊Analysis自動(dòng)獲得分析結(jié)果，在Report界面察看結(jié)果。

【質(zhì)量控制】
陰性質(zhì)控品：FAM檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，VIC檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線為明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；
陽(yáng)性質(zhì)控品：FAM檢測(cè)通路擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，且FAM檢測(cè)通道擴(kuò)增曲線 Ct值≤32；
以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。

【結(jié)果判定】
1.如果檢測(cè)樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應(yīng)體系FAM檢測(cè)通道均無(wú)擴(kuò)增曲線或Ct值＞40，且在VIC檢測(cè)通道均有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，可判樣品為H7N9禽流感病毒陰性；
2.如果檢測(cè)樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增曲線在FAM,VIC檢測(cè)通道均有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且FAM檢測(cè)通道Ct值≤40；可判樣品為H7N9禽流感病毒陽(yáng)性；
3.如果檢測(cè)樣品的AIV H7或N9 RT-PCR反應(yīng)體系僅其中之一的擴(kuò)增曲線滿足判為陽(yáng)性的要求，則需重復(fù)檢測(cè)；若重復(fù)檢測(cè)結(jié)果為H7及N9均陽(yáng)性，則判H7N9禽流感病毒陽(yáng)性；若重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為H7（或N9）陽(yáng)性，則只能判禽流感病毒H7（或N9）亞型陽(yáng)性，并建議以其他方法做進(jìn)一步確認(rèn)。

【檢測(cè)方法的局限性】
1.樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送及保存質(zhì)量有關(guān)。
2.樣本處理時(shí)沒(méi)有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。
3.病毒在流行過(guò)程中的基因突變則也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取試劑進(jìn)行樣本處理時(shí)核酸提取效率存在一定差異，本試劑盒推薦使用本公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒（離心柱法），用戶可根據(jù)具體要求進(jìn)行選擇確認(rèn)。
5.本檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，如需確診病例請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀及其他檢測(cè)手段.

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
根據(jù)產(chǎn)品分析性能評(píng)估結(jié)果，本試劑盒的分析靈敏度為1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒H1亞型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亞型病毒、禽流感H9亞型病毒等）無(wú)交叉反應(yīng)。

【注意事項(xiàng)】
1.實(shí)驗(yàn)室管理應(yīng)嚴(yán)格按照PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范，實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)），所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；
2.為試劑和標(biāo)本準(zhǔn)備階段提供生物安全柜，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；
3.試劑使用前要*解凍，8,000rpm離心數(shù)秒后使用；
4.標(biāo)本制備區(qū)所用過(guò)的吸頭請(qǐng)打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；
5.實(shí)驗(yàn)完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外線燈處理工作臺(tái)和移液器；
6.本試劑盒內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》。