包涵體大量純化試劑盒包涵體微量純化試劑盒（CAT#：90508）的大提升級(jí)產(chǎn)品，用于大量，快速的提取高質(zhì)量的包涵體。

包涵體大量純化試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 大量提取，1 次可處理多達(dá) 5 升的菌液，相當(dāng)于 50 次中量提取。
2. 適合制備級(jí)別的包涵體純化，需在 50 mL 以上的離心管或離心瓶中完成。
3. 能有效去除包涵體中的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等非重組蛋白成份，使重組蛋白在包涵
體中所占比重達(dá)到 60%以上。
4. 即可以選擇高壓裂解法，也可以采用酶學(xué)裂解法裂解細(xì)菌。
5. 得到的包涵體可以用于重折疊，也可以用于凝膠層析和動(dòng)物免疫。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 2 次包裝
溶液 A 90510A 100 mL
溶液 B 90510B 250 mL×2
包涵體溶解液 100 mL
溶菌酶 100406 100 mg
使用手冊(cè) 90510sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，4℃保存（溶菌酶需要-20℃保存，包涵體溶解液可以室溫保存），有效
期一年。
自備試劑 如果得到的重組蛋白確有降解則需要自備蛋白酶抑制劑混合物（CAT#：80808）
使用方法 一． 細(xì)胞沉淀：
1. 轉(zhuǎn)移 1-5 升菌液到干凈的、預(yù)稱重量的塑料離心瓶中。如果離心瓶體積不夠大，
可以分多次反復(fù)離心收集。
2. 5,000 g （相當(dāng)于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭 5500 rpm） 4℃離心 15-30 分鐘，小
心棄上清。
3. 復(fù)稱重量，差值就是細(xì)菌的濕重。1 升的過夜培養(yǎng)的大腸桿菌濕重一般為 3 克，
所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克細(xì)菌。注意：后續(xù)操作的很多溶液都是按
此步得到得細(xì)胞濕重添加。
4. 細(xì)胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。
二． 細(xì)胞裂解(下面兩法中選其一)：
高壓破碎法（French Press）+超聲法（推薦方法）
1. 按每克細(xì)菌濕重加入 3 mL 溶液 A 重懸細(xì)胞，可以用玻璃棒攪拌或用 Waring
搗碎機(jī)勻漿（如果細(xì)菌濕重超過 10 克）使細(xì)菌懸浮，直到檢測(cè)不到成塊的細(xì)
胞為止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其終濃度為 0.2mg/mL。
2. 讓細(xì)胞通過壓力為 16000-18000 lb/in2的高壓細(xì)胞破碎儀，收集的細(xì)胞裂解
液需放冰上。
3. 重復(fù)上步操作一次或多次，直到絕大部分細(xì)菌都被裂解。注意：每次處理后zui
在顯微鏡下檢查細(xì)菌裂解的比例。
4. 將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理 5 分鐘，工作狀態(tài)
為 50%（開 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒）。此過程中zui將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力
攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會(huì)使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。
酶法+超聲法（在沒有高壓破碎儀器時(shí)首方法）
1. 按每克細(xì)菌濕重加入 3 mL 的含溶菌酶的溶液 A 重懸細(xì)胞，可以用玻璃棒攪拌
細(xì)菌沉淀使之懸浮。
2. 在細(xì)菌懸浮液中加入溶菌酶干粉，使其終濃度為 0.2mg/mL，攪拌混勻后 37℃
放置 30 分鐘裂解細(xì)菌，其間不時(shí)需要用玻璃棒混勻。細(xì)菌釋放出的 DNA 將
使裂解物變得十分粘稠。如果不粘稠，說明裂解不充分，需要繼續(xù)裂解，否則
完整細(xì)菌將和包涵體一起沉淀，影響包涵體的純度。由于處理量大，zui在顯
微鏡下檢查細(xì)菌是否充分裂解。
3. 將細(xì)胞裂解液置于冰浴中，用超聲破碎儀滿功率下超聲處理 5 分鐘，工作狀態(tài)
為 50%（開 0.5 秒，關(guān) 0.5 秒）。此過程中zui將細(xì)胞裂解液放冰上并用磁力
攪拌器攪拌，否則產(chǎn)生的熱量會(huì)使包涵體蛋白變性，在純化中丟失。
三． 包涵體純化：
1. 將超聲處理的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到離心瓶中，22，000g 4℃下高速離心 60 分鐘
（注意：轉(zhuǎn)子不同其對(duì)應(yīng)的離心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶
形式存在的重組蛋白，可以保留作為 SDS-PAGE 對(duì)照樣品。
2. 將沉淀（主要由包涵體構(gòu)成）懸浮在預(yù)冷的溶液 B 中。每克細(xì)菌需要 5 mL 溶
液 B，1 升細(xì)菌的濕重約 3 克，大約需要 15 mL 溶液 B，用玻璃棒或勻漿器
攪拌混勻后室溫放置 5 分鐘。
3. 22，000g 4℃下高速離心 30 分鐘，沉淀將出現(xiàn)三層，zui下面的是未*破裂
的細(xì)胞碎片，其上是包涵體，zui上層的松軟沉淀是細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜。如果處
理過程中使用過溶菌酶，則此層較薄。小心收集上清，可以作為包涵體*次
洗滌的對(duì)照樣品。
4. 重復(fù)第 8-第 9 步直到上清變清和zui上層細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜松軟沉淀消失，此
過程一般需要重復(fù)洗滌 2 次（共 3 次洗滌），小心收集上清作為包涵體第二次
洗滌和第三次洗滌的對(duì)照樣品。本試劑盒提供的溶液 B 足夠一次 5 升規(guī)模的
提取洗 3 次，如需更多溶液 B 請(qǐng)單獨(dú)購買。
5. 上步得到的沉淀即為包涵體，其中重組蛋白一般占 60%重量，其余 40%為其
他蛋白質(zhì)。此沉淀可以長(zhǎng)期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫動(dòng)物
制備抗體，還可以直接進(jìn)入下面得包涵體的溶解步驟。
6. 估計(jì)重組蛋白的產(chǎn)率：首先需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)知道重組蛋白的表達(dá)水品，如果表
達(dá)水平為 1%，則 1 克濕重的細(xì)菌中將含有 1 mg 重組蛋白質(zhì)。此法得到的重
組蛋白質(zhì)的回收率一般在 75%，即 1mg 重組蛋白質(zhì)能得到 0.75 mg，丟失
0.25mg。
四．包涵體的溶解：
1. 在室溫下，將包涵體溶解液加入到包涵體沉淀中，用槍頭充分吹打后漩渦震蕩。
如果需要將溶解的包涵體直接用于凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，則按每克原始細(xì)
胞濕重加入 1 mL 包涵體溶解液，重組蛋白的濃度約為 4-5 mg/mL；如果需
要將溶解的包涵體直接用于蛋白質(zhì)折疊，則按每克原始細(xì)胞濕重加入 3 mL 包
涵體溶解液, 重組蛋白的濃度約為 1-2 mg/mL；注意：包涵體溶解液低溫放
置會(huì)產(chǎn)生沉淀，必須 45-65℃溶化并混勻后才能使用。
2. 室溫放置 1 小時(shí)使蛋白質(zhì)充分溶解。
3. 100,000g 4℃離心 60 分鐘(轉(zhuǎn)速需要根據(jù)離心機(jī)轉(zhuǎn)子的大小換算)，小心收集
上清，保留不溶性沉淀。注意：檢查離心管能否承受此離心力。SDS-PAGE
檢查是否大部分重組蛋白都在上清中。如果沒有，說明包涵體沒有*溶解，
需要用適當(dāng)增加包涵體溶解液的用量。
4. 將上清（溶解的包涵體）分成 10-20mL 一份，放于塑料離心管中（不要超過
離心管容量的 70%）置-80℃長(zhǎng)期保存或直接用于復(fù)性等試驗(yàn)。由于不同的蛋
白質(zhì)有不同的*復(fù)性條件，需要用戶自己摸索。包涵體純化過程中引入了溶
菌酶，在 SDS-PAGE 分析時(shí)可能有額外條帶出現(xiàn)。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 包涵體微量提取試劑盒（CAT#：90508-50），包涵體中量提取試劑盒（CAT#：
90509-5）

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