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本產(chǎn)品是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè) Cry1A(b)基因的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)： 1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。 2. 根據(jù) Cry1A(b)基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專一性地檢測(cè)出樣品中的 Cry1A(b)基因。 3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。 4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。 5. 本產(chǎn)品只能用于科研，足夠 50 次 20μL 體系的熒光定量 PCR。

成分 編號(hào) 十孔盒包裝 2×Probe qPCR Magic Mix 190303 500 μL（本色蓋） 熒光 PCR 專用模板稀釋液 180701 1 mL（黃蓋） Cry1A(b)基因探針法 qPCR 引物混 合液 15-74110yw 100 μL（白蓋） Cry1A(b)基因 qPCR 探針 15-74110pb 50 μL（棕色管） Cry1A(b)基因探針法 qPCR 陽性對(duì) 照 (1×10E8 拷貝/μL) 60908-74110p c 50 μL（黃蓋） 使用手冊(cè) 15-74110sc 1 份

 

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。 由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能 污染樣品或本試劑盒的其他成分） 1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。 2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭， 下同）。 3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

 二、樣品 DNA 的制備 7. 如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性 對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。 8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼 容。 三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行） 9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè) 用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用 水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模 板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。 10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好 后最后加）： 

 成分 樣品管 N+2 個(gè) PCR 陰 性對(duì)照管 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7 管） 2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL Cry1A(b)基因 qPCR 探針 1 μL 1 μL 各 1 μL Cry1A(b)基因探針法 qPCR 引物 混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL N+2 個(gè)待測(cè) DNA 模板 7 μL - - 超純水 - 7 μL - 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 （2-7 號(hào)） - - 各 7 μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…）

 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。 13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大 于或等于 35。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該 小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性，如果小 于或等于 30 則為陽性。如果在 30-35 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值 小于 35，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。