DNA Shuffling試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn) DNA Shuffling 即 DNA 分子的體外同源重組，它是一種分子水平上的定向進(jìn)化（directed evolution）技術(shù)，它以一個(gè)或多個(gè)基因?yàn)槠鹗疾牧希ㄟ^先隨機(jī)斷裂成小片段，再進(jìn)行互為模板和引物的 PCR（無外加引物），Z后再進(jìn)行常規(guī)PCR（外加引物）等處理，Z后得到含有大量 DNA 重組突變的 PCR 產(chǎn)物。

DNA Shuffling試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn) DNA Shuffling 即 DNA 分子的體外同源重組，它是一種分子水平上的定向進(jìn)化(directed evolution)技術(shù)，它以一個(gè)或多個(gè)基因?yàn)槠鹗疾牧?，通過先隨機(jī)
斷裂成小片段，再進(jìn)行互為模板和引物的 PCR（無外加引物），zui后再進(jìn)行常規(guī)
PCR（外加引物）等處理，zui后得到含有大量 DNA 重組突變的 PCR 產(chǎn)物。

DNA Shuffling試劑盒其原理示意圖如下：

就是根據(jù)上述原理優(yōu)化改進(jìn)而成，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，無需單獨(dú)準(zhǔn)備各成分。
2. 操作手冊(cè)經(jīng)過優(yōu)化，1-2 天即可完成，節(jié)省大量優(yōu)化時(shí)間。
3. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 十孔盒包裝
PCR Mix 3.0（含染料） 90805A 1 mL×3
DNase I 溶液（1U/μL） 90903A 10 μL
溶液 A，10× 131178A 100 μL
溶液 B，10× 131178B 100 μL
超純水 100935 1 mL
使用手冊(cè) 131178sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。 自備試劑 待突變基因片段、DNA Shuffling 引物（第二輪 PCR 引物）、膠回收試劑盒。
使用方法 1. 待突變基因片段的制備：待突變基因片段可以用含一個(gè)或多個(gè)同源基因的質(zhì)
粒為模板、用 PCR 法或酶切法制備。制備時(shí)需保證含同源基因（或此同源
基因的一部分）的 DNA 段總長度不要超過 1kb，同時(shí)比 DNA shuffling
終產(chǎn)物（第二輪 PCR 產(chǎn)物）長 200-400 bp。每次 DNA Shuffling 實(shí)驗(yàn)至
少需要 2 μg 起始 DNA 段（如果含幾個(gè)同源基因片段，則彼此的比例為
1:1:1），zui多可以達(dá) 5 μg 起始 DNA 段，并且必須通過膠回收的方法回
收，以便*去除殘留的質(zhì)粒模板、引物和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物等。zui后需用分
光光度法準(zhǔn)確定量。如果不去除此步的引物，其將對(duì)后續(xù) PCR 造成嚴(yán)重干
擾。
2. 提前準(zhǔn)備 37℃和 75℃水浴，同時(shí)新鮮配制 0.1U/μL 的 DNase 工作液放
冰上待用（必須在用時(shí)才配制，方法是將 1 μL 本試劑盒提供的 1U/uL 的
DNase I 溶液和 1 μL 溶液 A 和 8 μL 超純水混合）。此溶液需在 24 小時(shí)
內(nèi)使用。
3. 在一個(gè)離心管中，按順序加入下列成分：
成分 用量
待突變同源基因片段（第 1 步制備所得） 2-5 μg
溶液 A 5 μL
溶液 B 5 μL
DNase I 工作液（第 2 步制備所得） 2 μL
補(bǔ)超純水到 50 μL
4. 充分輕柔吹打混勻后 37℃水浴 8 分鐘，然后立即放 75℃水浴處理 10 分鐘
以滅活 DNase I。
5. 在 2-3%瓊脂糖凝膠上電泳，用常規(guī)的膠回收法回收 25-150 bp 范圍的所
有片段待用。注意：一定要加合適的 DNA marker 以便確定片段范圍。
6. 分光光度法精確測(cè)定回收片段的濃度。
7. 在 PCR 管中按順序加入 0.5 μg 上步回收得到的回收片段、50 μL PCR Mix
3.0、加超純水到 100 μL。
8. 按下面的 PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行*輪無引物 PCR：
過程 溫度 時(shí)間
PCR 前變性 94℃ 150 s
PCR 反應(yīng) 94℃ 30 s
（40 循環(huán)） 47.5℃ 45 s
72℃ 10 s，每次循環(huán)后增加 5s
PCR 后延伸 72℃ 10 min
9. 取 5-10 μL 進(jìn)行電泳檢測(cè)（本 PCR mix 含上樣成分，可以直接上樣。紅色
染料的泳動(dòng)速度相當(dāng)于 50bp DNA），然后進(jìn)行 PCR 回收，去除小片段 DNA
的干擾，得到*輪 PCR 產(chǎn)物。
10. 將回收的*輪 PCR 產(chǎn)物原液、10 倍、20 倍和 50 倍稀釋液各 1uL 作為
PCR 模板設(shè)置 4 管第二輪 PCR 反應(yīng)。
成分 用量
PCR 模板 1 μL
PCR Mix 3.0 50 μL
自備 DNA Shuffling 引物 各 30 pmol
超純水 加水到 100 μL
11. 按下列 PCR 參數(shù)進(jìn)行第二輪 PCR。
過程 溫度 時(shí)間
活化 94℃ 150 s
PCR 反應(yīng)
（25 次循環(huán)）
94℃ 30 s
47.5℃ 45 s
72℃ 60 s，每次循環(huán)后增加 5s
PCR 后延伸 72℃ 10 min
12. 電泳檢測(cè) 4 個(gè) PCR 產(chǎn)物，回收預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（略）。 答客問 Q：易錯(cuò) PCR 和 DNA Shuffling 有何區(qū)別？

A：前者引入的是點(diǎn)突變，后者引入的是重組突變。示意圖如下：
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 即用型易錯(cuò) PCR 試劑盒（CAT#:101005-100）