結(jié)核桿菌熒光定量PCR試劑盒適用于絕大多數(shù)致病性結(jié)核桿菌。它具有下列特點(diǎn)：1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。2. 根據(jù) TB 基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性高。預(yù)期的 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為 111 bp。

世界上大約 30%的人口感染過結(jié)核桿菌（TB），每年 TB 新增患者 900 多萬，死亡病例達(dá) 170 萬。TB 的病原菌主要分為人型結(jié)核桿菌和牛分枝桿菌，近年來又出現(xiàn)了結(jié)核桿菌復(fù)合群（MTC）變異株。結(jié)核桿菌熒光定量PCR試劑盒即是基于熒光探針 PCR 法的 TB
核酸的快速檢測(cè)試劑盒，適用于絕大多數(shù)致病性結(jié)核桿菌。

結(jié)核桿菌熒光定量PCR試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確快速。
2. 根據(jù) TB 基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，引物經(jīng)過優(yōu)化，特異性高。預(yù)期的 PCR
產(chǎn)物長(zhǎng)度為 111 bp。
3. 采用了改良后的 Taq Polymerase，具有高擴(kuò)增效率，高擴(kuò)增靈敏度，高擴(kuò)增
特異性的特點(diǎn)。
4. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 小扁盒包裝
qPCR Mix（with dye），2× 11-180201a 500 μL
TB 專一性引物對(duì) yw13791380 100 μL
TB 陽性對(duì)照（1×10E10 拷貝/μL） yw13811382 10 μL
超純水 100935 1 mL
使用手冊(cè) 11-171201sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。 自備試劑 樣品等
使用方法 一、樣品 DNA 的制備 j
用自選方法提取待測(cè)樣品的總 DNA。注意：待測(cè)樣品的 DNA 純化方法是決定
檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品 DNA，后面的 PCR 再靈敏也
不能提高整體檢測(cè)靈敏度。
二、制備 TB 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線（以 10-10E6 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃
度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品
或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)
品不提供活體病毒做陽性對(duì)照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的 DNA
片段作為陽性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2 和 1 號(hào)。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（zui用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用超純水 10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：
請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至 10E7 拷貝/μL，建議每次稀
釋 10 倍梯度稀釋，梯度稀釋至 10E7 拷貝/μL）。
4. 在 6 號(hào)管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的 TB 陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充
分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的 TB 陽性對(duì)照。
5. 換槍頭，從 6 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5
拷貝/μL 的 TB 陽性對(duì)照。
6. 換槍頭，從 5 號(hào)管中取 5 μL 溶液到 4 號(hào)管中，得 10E4 拷貝/μL 的 TB 陽
性對(duì)照。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 10E3 拷貝/μL 、10E2 拷貝/μL 和 10E1 拷貝/μ
L 三個(gè)稀釋度的 TB 陽性對(duì)照。
8. NC 管中不加任何陽性對(duì)照。
9. 從 1-6 號(hào)管中分別取 5 μL 和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量 PCR（見下步），每個(gè)
樣品做 3 次重復(fù)。
三、qPCR 檢測(cè)（20 μL 體系）
1. 在 PCR 管中加入下列成分（待測(cè)樣品需要做三次重復(fù)，下表只列出一次）：
成分 樣品
陽性對(duì)照
1-6 管
陰性對(duì)照
qPCR Mix（含染料），2× 10 μL 10 μL 10 μL
樣品 DNA(10-100ng) 1-5 μL 不加 不加
TB 陽性對(duì)照
(10E1-10E6 拷貝/uL)
不加 5 μL/管 不加
自備 50×ROX 或 ROX II (見注) 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL
TB 專一性引物對(duì) 2 μL 2 μL 2 μL
補(bǔ)水 到 20 μL 到 20 μL 到 20 μL
注: 需要 ROX 的機(jī)型：ABI Prism 7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step
One Plus。
需要 ROX II 的機(jī)型：ABI Prism 7500、7500 Fast、MJ Research Chromo4、Opticon、
Corbett Rotor Gene 3000、Agilent Mx3000P。
不 需 要 ROX 的 機(jī) 型 ： iCycler IQ 、 MX3000 、 MX4000 、 RotorGene 6000 和
LightCycler480。
2. 上機(jī)，請(qǐng)按照不同熒光定量 PCR 儀器的使用手冊(cè)設(shè)置如下 PCR 反應(yīng)參數(shù):
步驟 溫度 時(shí)間
酶活化 95℃ 120 s
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
95℃ 30 s
60℃ 30 s
72℃ 30 s
溶解曲線分析
3. 數(shù)據(jù)采集
檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交所產(chǎn)生的熒光信號(hào)，獲取數(shù)據(jù)。
四、數(shù)據(jù)處理
以 6 個(gè) TB 基因陽性對(duì)照濃度（10E1-10E6 拷貝/uL）的 log 值為橫軸，以 Ct
值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值為縱軸，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)
算出樣品 DNA 的濃度。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 豬傳染性胃腸炎病毒 RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（CAT#:11-210）
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