炭疽桿菌PCR檢測試劑盒用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測，禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。檢測原理如下：鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟（TAL）的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品, 鱟試劑中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下(溫度，pH 值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活 C 因子，引起一系列酶促反應(yīng)，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為多肽和黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。在一定時(shí)間內(nèi)，pNA 的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量樣品的內(nèi)毒素濃度。同時(shí)，對(duì)硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545nm），避免了樣品本身的顏色對(duì) 405nm 處吸收峰的干擾。特異性鱟試劑是在鱟試劑的配方中添加 G 因子旁路抑制劑，使鱟試劑對(duì)（1,3）β-D-葡聚糖產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。本鱟試劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)是特異的，抗干擾能力比普通鱟試劑更強(qiáng)，使用時(shí)只需
用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水直接溶解即可，不需另外添加 G 因子抑制劑（抗增液）。
炭疽桿菌PCR檢測試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1. 僅用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測，嚴(yán)禁試劑以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。
2. 接觸試劑及樣品的所有器皿必須是除熱原的。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)防止微生物的污染。該說明書中的除熱原指內(nèi)毒素濃度小于 0.005 EU/ml。玻璃器皿可經(jīng) 250℃干烤至少 60 分鐘去除熱原。
3. 待測樣品的 pH 值應(yīng)在 6.0–8.0 之間，若超出此范圍，需用除熱原的緩沖液、0.1M 氫氧化鈉或 0.1M 鹽酸調(diào)節(jié)。
4. 當(dāng)樣品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)時(shí)，須進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。
規(guī)格及成分 成份 32 次包裝
細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品 2 支
特異性鱟試劑 2 支×1.7 mL
顯色基質(zhì) 2 支×1.7 mL
偶氮化試劑 1 2 支×10 mL
偶氮化試劑 2 2 支×10 mL
偶氮化試劑 3 2 支×10 mL
HCl (反應(yīng)終止劑) 50 mL
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 50 mL×2 瓶
使用手冊 1 份
除熱原試管，10×75mm 10×5 支
除熱原吸頭，1000VL 10×4 支
除熱原吸頭，200VL 1 盒

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，4℃避光保存，有效期兩年。
自備試劑儀器
旋渦混合儀、移液器、多道移液器、試管架、恒溫水浴箱（37±1℃）、分
光光度計(jì)。
使用方法 1. 樣品的貯存與預(yù)處理
1.1 若樣品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會(huì)對(duì)偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng)而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒。
1.2 若樣品的本底吸光度值大于0.5,必須對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后再檢測。
1.3 若樣品顏色較深(例如溶血)，或在酸性條件下顏色加深(例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì)),必須設(shè)置樣品空白管以扣除樣品自身的顏色本底。樣品空白管不加入特異性鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑(該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水)代替。其余操作同樣品管。
2. 實(shí)驗(yàn)操作
2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為0.01, 0.025, 0.05, 0.1EU/mL
或0.1, 0.25, 0.5,1.0EU/mL。稀釋方法如下（以0.1, 0.25, 0.5, 1.0
EU/mL為例）：取細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品1支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品使
用說明稀釋為10EU/mL的內(nèi)毒素溶液，再稀釋為1.0EU/mL的內(nèi)毒素
溶液，以 1.0EU/mL 的內(nèi)毒素溶液為母液按下表稀釋成
0.1,0.25,0.5,1.0 EU/mL的濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在4
小時(shí)內(nèi)用完。
表1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
內(nèi)毒素濃度(EU/mL)
1 0.5 0.25 0.1
加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(mL) 0 0.5 0.75 0.9
加 1EU/ml 內(nèi)毒素溶液(mL) 1 0.5 0.25 0.1
2.2 陰性對(duì)照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
2.3 特異性鱟試劑、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑等的溶解
特異性鱟試劑：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于特異性鱟試劑中，輕輕振搖使特異性鱟試劑*溶解, 注意不要用旋渦混勻劇烈振搖。溶解的特異性鱟試劑應(yīng)在10分鐘內(nèi)用完。顯色基質(zhì)：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使顯色基質(zhì)*溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于4 ºC貯存8小時(shí)以內(nèi)。
偶氮化試劑1：按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑鹽酸于偶氮化試劑1中，
偶氮化試劑2：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑2中，
偶氮化試劑3：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑3中，
偶氮化試劑溶液可于4ºC貯存1周。
2.4 實(shí)驗(yàn)操作
 取無熱原試管，加入100 uL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，或待測樣品。再加入100 uL特異性鱟試劑溶液，混勻，37ºC溫育T1分鐘。溫育結(jié)束，加入100 uL顯色基質(zhì)溶液，混勻，37ºC溫育T2分鐘。溫育結(jié)束，加入500 uL偶氮化試劑1溶液，混勻，加入500uL偶氮化試劑2
溶液，混勻加入500 uL偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5分鐘，于545nm
波長處讀取吸光度值。(見表２)
表 2 實(shí)驗(yàn)操作
 陰性對(duì)照 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn) 樣品
加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(uL) 100
加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(uL) 100
加待測樣品(uL) 100
加特異性鱟試劑(uL) 100 100 100
混勻，37ºC 溫育 T1分鐘
加顯色基質(zhì)溶液(uL) 100 100 100
混勻，37ºC 溫育 T2分鐘
加偶氮化試劑 1 溶液(uL) 500 500 500
混勻，加偶氮化試劑2溶液(uL) 500 500 500
混勻，加偶氮化試劑3溶液(uL) 500 500 500
混勻,靜置5分鐘，于λ545nm測OD值
本試劑盒建議反應(yīng)時(shí)間T1及T2如下：
內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)范圍（EU/mL）為0.01-0.1，T1為30分鐘，T2為6分鐘；
內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)范圍（EU/mL）為0.1-1，T1為10分鐘，T2為6分鐘。
3. 數(shù)據(jù)處理
建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y = b X + a，其中 Y為545nm處吸光度值，X為內(nèi)毒素
的濃度，b為直線斜率，a為Y軸截距。
當(dāng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同時(shí)滿足如下三個(gè)條件時(shí)實(shí)驗(yàn)才有效：
3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r≥0.980，
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線zui低點(diǎn)的Y值大于陰性對(duì)照的Y值，
3.3 待測樣品平行管的平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間內(nèi)。
待測樣品的干擾實(shí)驗(yàn)
待測樣品的干擾實(shí)驗(yàn)詳見《中華人民共和國藥典》2010細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》
的“光度測定法干擾實(shí)驗(yàn)”。當(dāng)特異性鱟試劑、待測樣品的來源、配方、
生產(chǎn)工藝改變或?qū)嶒?yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須
進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn),步驟如下:
1 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為λm），作為待測樣
品干擾實(shí)驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度，配制含λm內(nèi)毒素的待測樣品陽性對(duì)照，
測量出該溶液的內(nèi)毒素濃度,稱為Cs；
2 測量出未添加外源內(nèi)毒素的待測樣品溶液內(nèi)毒素濃度,稱為Ct；
3 計(jì)算該實(shí)驗(yàn)條件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm×100%
4 當(dāng)R在50%～200%之間，則認(rèn)為在此實(shí)驗(yàn)條件下待測樣品溶液不存在干擾
作用。
5 當(dāng)R在50%～200%之外，需對(duì)待測樣品進(jìn)行系列稀釋(稀釋倍數(shù)不得超過zui大有效 稀釋倍數(shù)MVD)或進(jìn)行其它處理消除干擾,每一稀釋溶液都重復(fù)步驟1-3,直到內(nèi)毒素的回收率R在50%～200%之間。選擇回收率Rzui接近100%的稀釋倍數(shù)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測。
附件
細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品使用說明
本品為白色疏松海綿狀固體，系參照中國藥品生物制品檢定所的細(xì)菌內(nèi)
毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的大腸桿菌內(nèi)毒素凍干品，供鱟實(shí)驗(yàn)中的特異性鱟試
劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和各種陽性對(duì)照。
用法：
1. 溶解：加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）1 mL, 復(fù)溶后置渦旋混勻器
上混勻15 min。
2. 稀釋：將上述內(nèi)毒素溶液進(jìn)一步用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成各個(gè)不同濃
度2λ、λ、0.5λ、0.52λ等濃度。
注意事項(xiàng)：
1. 本品為一次性使用。僅供體外鱟實(shí)驗(yàn)檢測，禁止用于注射、口服等。
2. 實(shí)驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)過處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，可以經(jīng)
250℃干烤至少60分鐘處理，也可以采用其他確保不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的
適宜方法處理。實(shí)驗(yàn)操作過程中應(yīng)該防止微生物的污染。
3. 稀釋的內(nèi)毒素溶液靜置時(shí)間超過10分鐘，用前需要在渦旋混勻器上劇烈混
勻1分鐘，放置4小時(shí)以上的內(nèi)毒素溶液應(yīng)丟棄。