天凈沙DNA甲基化修飾試劑盒血液樣品和各種臨床樣品（包括組織檢查、FFPE 切片或少量細(xì)胞樣品）都是基因表達(dá)分析和診斷的常見材料，但這些樣品通常數(shù)量有限，質(zhì)量不高，并且還沒
法進(jìn)行第二次取樣。所以得到足夠 RNA 量供后續(xù)試驗(yàn)是一個(gè)非常棘手的瓶頸。為解
決這一問題，

天凈沙DNA甲基化修飾試劑盒本公司根據(jù) Ribo-SPIA 技術(shù)，開發(fā)了本產(chǎn)品。Ribo-SPIA 技術(shù)的核心
是利用隨機(jī)和帶 oligo dT 尾巴的 DNA/RNA 嵌合引物，以完整或降解的總 RNA 為
模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并得到雙鏈 cDNA、RNase H 不間斷地在 cDNA 第 1 鏈中的 RNA
部分產(chǎn)生裂口，DNA 聚合酶以此裂口為基礎(chǔ)進(jìn)行鏈取代聚合反應(yīng)，產(chǎn)生 cDNA 單鏈。
此技術(shù)原理圖如下：
具有下列特點(diǎn)：
1. 能用 500pg-50ng 總 RNA 模板擴(kuò)增得到 ug 級(jí)別的單鏈 cDNA。
2. 步驟簡(jiǎn)單方便，擴(kuò)增在恒溫進(jìn)行，只需要 5 個(gè)小時(shí)，不需要特殊儀器設(shè)備。
3. 保真性好，保持 RNA 樣品中各分子的相對(duì)豐度。
4. 完整或降解的 RNA 均可作為模板，尤其適用于 RNA 產(chǎn)量和質(zhì)量都不高的樣品。
但降解 RNA 作為模板時(shí)產(chǎn)量低，且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度比較短。
5. 擴(kuò)增得到的單鏈 cDNA 能直接用于各種后續(xù)試驗(yàn)，包括 qPCR、芯片表達(dá)分析、
雜交反應(yīng)等。
6. 本產(chǎn)品足夠做 10 次雙鏈 cDNA 的合成，20 次 SPIA 擴(kuò)增。
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 20 次塑料袋包裝
cDNA 一鏈合成緩沖液 130308A 40 uL
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 60905 10 uL
cDNA 二鏈合成緩沖液，5× 130308B 160 uL
cDNA 二鏈合成酶混合液 20× 130308C 40 uL
SPIA RT 引物混合液 Yw11931204 40 uL
SPIA 反應(yīng)液，5× 131083A 320 uL
SPIA 擴(kuò)增引物 Yw1192 320 uL
SPIA 酶混合液 131083D 120 uL
超純水 100935 1 mL
使用手冊(cè) 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期為 1 年。
使用方法 一：樣品 RNA 的制備
不含 RNA 制備相關(guān)試劑，用作模板的每個(gè)批次的 RNA 樣品zui先做一
個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)?？?RNA 樣品的濃度必須在 1-20ng/uL，一次反應(yīng)所需總 RNA 的量為
500pg-50ng。過低則需要濃縮，過高則需要用無 RNase 的水稀釋。RNA 不能含
DNA、蛋白質(zhì)和殘留有機(jī)溶劑（如酚和乙醇）污染。尤其是要去除 DNA 污染，因
為 DNA 也可以被擴(kuò)增，同時(shí)其存在會(huì)干擾 RNA 濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性。Trizol 提取的
RNA 常含殘留的酚和乙醇，故zui用柱式方法再純化一次。微量提取時(shí)不能使用核
酸類的助沉劑。RNA 的 RIN 值z(mì)ui在 2 以上。
二：一管式雙鏈 cDNA 的合成
1. 在 0.5mL PCR 管中，按下表配制雙鏈 cDNA 合成反應(yīng)。注意：zui每次實(shí)驗(yàn)
設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照組，在此對(duì)照中用超純水替代自總 RNA:
成分 用量
自備的總 RNA 4 uL（500pg-50ng）
SPIA RT 引物 Mix 20uM 1 uL
65℃ 5 分鐘后室溫放置 2 分鐘，短暫離心后放 4℃
cDNA 一鏈合成緩沖液 4 uL
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 uL
輕柔吹打混勻后放冰上，然后 4℃ 2 分鐘，25℃ 30 分鐘，42℃
15 分鐘，70℃ 15 分鐘，zui后 4℃短暫放置后加入下列成分，
得到 80uL 的 cDNA 第二鏈合成反應(yīng)體系。
超純水 50 uL
cDNA 二鏈合成緩沖液 16 uL
cDNA 二鏈合成酶混合液 4 uL
輕柔吹打混勻后，短暫離心，4℃保溫 1 分鐘，25℃保溫 10 分
鐘，50℃保溫 30 分鐘，80℃保溫 20 分鐘，zui后 4℃放置待用
三：SPIA 擴(kuò)增（120uL 反應(yīng)體系）
2. 在 0.5mL PCR 管中，按下表配制 120uL 的 SPIA 反應(yīng)體系。注意：zui設(shè)置
兩個(gè)陰性對(duì)照組，在此兩個(gè)對(duì)照中分別用超純水替代 SPIA 引物和 cDNA 雙鏈
反應(yīng)液。
成分 用量
cDNA 雙鏈反應(yīng)產(chǎn)物 40 uL(來于上步)
SPIA 擴(kuò)增引物 16 uL
SPIA 反應(yīng)液，5× 16 uL
超純水 42 uL
94℃20 秒后 50℃放置復(fù)性待用
SPIA 酶混合液 6 uL
輕柔吹打混勻后得到 120 uL 反應(yīng)體系，4℃保溫 1 分鐘，47℃
保溫 75 分鐘，95℃保溫 5 分鐘，zui后 4℃放置待用
四：SPIA 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)
3. 取 5uL SPIA 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 PAGE 電泳檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)結(jié)果是產(chǎn)生長(zhǎng)度在
200-2000bp 之間的產(chǎn)物。
4. 如果產(chǎn)物將用于 PCR 定量，則可以不經(jīng)過純化直接使用，如果需要用于芯片雜
交和濃度測(cè)定，則需要按常規(guī)的方法純化 cDNA 以便去除殘留的 dNTP 和引物。
5. OD 檢測(cè)純度和濃度。在 OD260 的波長(zhǎng)下測(cè)樣品你給的光吸收。由于擴(kuò)增產(chǎn)
物是單鏈 DNA，故 1OD260=33ug/mL。
6. 所得 DNA 可以放-20℃長(zhǎng)期放置。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 天凈沙 Ribo-SPIA cDNA 擴(kuò)增試劑盒（CAT#：131083）