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接上期，30年前的無血清培養(yǎng)基里都含啥
三、無血清培養(yǎng)基
1979年神經(jīng)細胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個重要進展，用化學(xué)添加劑即可維持神經(jīng)細胞存活與生長而不需要在培養(yǎng)基中添加血清。其工作基礎(chǔ)是用合適的激素、營養(yǎng)物和促貼壁的物質(zhì)的組合置換培養(yǎng)基中的成分，后找到了適合大多數(shù)細胞培養(yǎng)的試劑配方，該配方稱為N2，專門用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)，早是用在B104大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系的培養(yǎng)。它的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數(shù)類型細胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解，有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
未料到的是上述配方構(gòu)成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細胞瘤細胞系快速增殖，隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在許多實驗室里已取代了有血清培養(yǎng)。在某些培養(yǎng)方案中，細胞直接進入無血清培養(yǎng)，這樣的培養(yǎng)基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經(jīng)元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細胞的增殖，故可使神經(jīng)元純化。
血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當(dāng)缺乏這些成分時，如神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長時，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進低密度培養(yǎng)細胞的存活。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而，無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時變小，特別是神經(jīng)元與膠質(zhì)共培養(yǎng)時，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質(zhì)如谷氨酸。
應(yīng)該注意，盡管無血清培養(yǎng)基是有化學(xué)限定性的，但在培養(yǎng)過程中它仍有變動，培養(yǎng)起始時可能有些物質(zhì)缺乏，而后細胞的產(chǎn)物可能積累，從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實是有另一方面的好處，即條件培養(yǎng)基（已培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基）的形成，條件培養(yǎng)基常常用來增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的發(fā)育。
生長因子絕大多數(shù)哺乳類胚胎神經(jīng)元有嚴格的營養(yǎng)要求，若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分，將會使絕大多數(shù)神經(jīng)元在體外培養(yǎng)的數(shù)天中死亡。解決這一問題有兩條思路，一是讓培養(yǎng)細胞提供自己的營養(yǎng)因子，二是在培養(yǎng)基中加入純的生長因子。如果細胞混合物能在高密度時生長，所需的生長因子便會積累到可觀的數(shù)值，尤其當(dāng)培養(yǎng)基很少變化時。若某種細胞混合物生長時有很少的營養(yǎng)需求，可保持培養(yǎng)基在一段時間里不作任何變動，以使?fàn)I養(yǎng)（生長）因子積累，而后促使所需要的細胞類型能夠生長。但是，這種對營養(yǎng)（生長）因子自身倚賴性亦有弊端，因為通常在混合細胞群體中細胞很難有同比例增殖，某些細胞會因生長條件的貧乏而受限制。另外，這種方法只能進行相當(dāng)高密度的細胞培養(yǎng)。因為培養(yǎng)基的條件在細胞的較低密度時變的不夠有效。不過某些時候純化神經(jīng)元群體的低密度培養(yǎng)可用條件培養(yǎng)基（經(jīng)過了高密度培養(yǎng)）進行，或在膠質(zhì)上生長的神經(jīng)元所用過的培養(yǎng)基來支持。
滿足神經(jīng)元營養(yǎng)需求的第二條途徑是向培養(yǎng)基中加入生長因子。通常用于組培的通用適宜因子是神經(jīng)生長因子NGF。不過，只有少數(shù)對這種蛋白質(zhì)有反應(yīng)的細胞類型的細胞才能生長。
許多PNS類型的神經(jīng)元在離體狀態(tài)時表現(xiàn)出簡單的營養(yǎng)需求，只需提供單一的營養(yǎng)因子就足以使其在低密度時增殖。例如，大鼠交感神經(jīng)元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經(jīng)元可在嚴格局限條件下生長好幾個月（即在無血清培養(yǎng)基中、或缺乏膠質(zhì)細胞、或在化學(xué)限定基質(zhì)上）。有證據(jù)表明NGF是活體中交感神經(jīng)元存活的生理調(diào)節(jié)因子。然而，交感神經(jīng)元也對來自膠質(zhì)細胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）有反應(yīng)，還有NT3、LIF與CNTF也對其有作用。在不產(chǎn)生GDNF或NT3的動物中，交感神經(jīng)元會有損傷。在離體與活體營養(yǎng)需求之間的差別或許可以用在不同環(huán)境中NGF含量和分布的不同來解釋，培養(yǎng)中的NGF彌散在整個環(huán)境中，而在活體內(nèi)，大部分區(qū)域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數(shù)實驗中已經(jīng)習(xí)慣了營養(yǎng)因子的大效應(yīng)使用量，其他營養(yǎng)因子的協(xié)同效應(yīng)在亞優(yōu)劑量下更容易觀察到。此外，高濃度的營養(yǎng)因子可使細胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應(yīng)的，低濃度的營養(yǎng)因子可能用來檢查表現(xiàn)型，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應(yīng)。有許多其他的PNS培養(yǎng)系統(tǒng)只需單一營養(yǎng)因子就可使有實用價值的細胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和大鼠背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元。不過，這些模型也有局限性。例如，培養(yǎng)中的睫狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元加入CNTF時，超過90%的神經(jīng)元能存活一個很長時期，但并未有跡象表明它屬于內(nèi)源的靶細胞來源的營養(yǎng)因子，而是有爭論的相關(guān)分子，GPA，扮演了這一角色。大鼠背根神經(jīng)節(jié)含有好幾種細胞群體，其中小細胞群、包括nocioceptive cell，對NGF有反應(yīng)，但其他神經(jīng)元，例如大細胞群中的proprioception 卻對不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子有反應(yīng)。因此，在大多條件下培養(yǎng)物的生長并不能忠實反映親代群體的所有特性，這一問題在CNS的細胞培養(yǎng)中特別突出，因為已有的經(jīng)驗表明，沒有一種培養(yǎng)基能適合于所有類型及亞類的神經(jīng)細胞的生長。
現(xiàn)有的證據(jù)已表明，CNS神經(jīng)元的營養(yǎng)需求比PNS的更復(fù)雜。對脊髓運動神經(jīng)元與視網(wǎng)膜節(jié)細胞神經(jīng)元的研究表明，這些神經(jīng)元與外周神經(jīng)元相比能對更為廣泛的營養(yǎng)因子起反應(yīng)。例如，至少發(fā)現(xiàn)了15種不同的分子可在離體條件下增加神經(jīng)元的存活。而且，已觀察到運動神經(jīng)元與視網(wǎng)膜對任何單獨的營養(yǎng)因子的存活反應(yīng)，與PNS中所觀察到的典型反應(yīng)相比，都要小得多。因此，大多數(shù)影響運動神經(jīng)元及視網(wǎng)膜節(jié)細胞的營養(yǎng)因子僅僅只能支持神經(jīng)元的亞群，而神經(jīng)元的達到一定存活要求諸多因子的結(jié)合。在視網(wǎng)膜節(jié)細胞的培養(yǎng)中，因子的合適組合（如BDNF、CNTF、IGF、bFGF）包括了來自不同生長因子家族的代表。這一結(jié)果的普遍性尚待進一步的證實，但敲除單一的營養(yǎng)因子基因之后，沒有表現(xiàn)出對CNS大多類群的神經(jīng)元的存活產(chǎn)生太大影響，這一觀察與上述的事實是一致的?，F(xiàn)已知少突膠質(zhì)細胞的長期存活也需要眾多營養(yǎng)因子的相互作用。