Invitrogen 原裝脂質(zhì)體3000操作說明：

從組織中提取總RNA 

1)液氮研磨，組織塊直接放入研體中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管進(jìn)行第2步操作。

2) 勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol，另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會(huì)不好，用電動(dòng)勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。從細(xì)胞中提取總RNA 。

1) 培養(yǎng)貼壁細(xì)胞：不須消化，可直接用Trizol進(jìn)行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比例加入。   

2) 懸浮細(xì)胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞，或107細(xì)菌細(xì)胞。   

2．細(xì)胞或組織加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時(shí)可放入-70℃長(zhǎng)期保持。  

3．12000rpm 離心5min，棄沉淀。  

4．按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻15分鐘，室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，   以免基因組DNA斷裂。  

5．4℃12000g離心15min。   

6．吸取上層水相，至另一離心管中。  

注：

1）Invitrogen 原裝脂質(zhì)體3000千萬不要吸取中間界面。   

2)若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。 

7．按0.5ml異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。  

8．4℃ 12000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。   

9．按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。  

10．4℃ 8000g離心5min，盡量棄上清。   

11．室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。  

12．可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃5-10min。  注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。  12、測(cè)O.D值定量DNA濃度。   

注：

1）此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之間。 

2) 產(chǎn)率估計(jì)：組織標(biāo)本：（ug RNA/mg組織）1-10ug，培養(yǎng)細(xì)胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。  

注：

1、組織或細(xì)胞量過少，可酌情減少Trizol用量。

2、組織或細(xì)胞用量過多，會(huì)引起DNA對(duì)RNA的污染。  

3、高蛋白，脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨  后須4℃ 1200離心10min去掉不溶物，再進(jìn)行下面操作，若頂層有脂肪物，則  也須去掉。

4、熱天提RNA，帶手套是必須的，手是RNase的主要來源。  

5、組織塊用液氮研磨，效果，若沒有液氮或電動(dòng)勻漿器，可用手動(dòng)勻漿器代替，此時(shí)組織塊不宜過大，且需先用眼科剪將組織絞碎，然后再充分研磨。