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一、堿變性法提取質(zhì)粒DNA

質(zhì)粒（Plasmid）是細(xì)菌染色體外能自身獨(dú)立復(fù)制的雙股環(huán)狀DNA。帶有遺傳信息，可賦予細(xì)菌某些新的表型。將質(zhì)粒指紋圖譜分析方法、質(zhì)粒DNA探針技術(shù)及檢測(cè)質(zhì)粒的PCR技術(shù)用于臨床感染性疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查已成為現(xiàn)實(shí)。質(zhì)粒作為載體在基因工程中起著重要的作用。

分離和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，但這些方法基本包括三個(gè)步驟：即細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增，細(xì)菌菌體的裂解；質(zhì)粒DNA的提取與純化。

本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用堿變性方法提取質(zhì)粒DNA。

原理

細(xì)菌培養(yǎng)物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后，菌體裂解，可使細(xì)菌的質(zhì)粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠（EB）染色后，在紫外線燈下可看到各種核酸帶發(fā)出的熒光。根據(jù)熒光的位置，可區(qū)分不同的核酸帶。

材料

1．菌株E.coliJM109（pUC19），E.coliRRI（pBR322）

2．試劑溶液Ⅰ（50mM葡萄糖，25mMTris.HclPH8.0，10mMEDTA）

溶液II（0.2NNaOH，1%SDS）用前新配制

溶液III（5mMKAc溶液PH4.8）

TE緩沖液（10mMTris.HCl，1mMEDTAPH8.0）

LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g，酵母粉5g，Nacl10g。加蒸餾水溶解，用NaOH調(diào)PH至7.5，加水至1000ml，15磅高壓滅菌15分鐘）。

方法

1．接種細(xì)菌于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)。

2．3000rpm/min，離心15min，棄上清。加入100ul溶液Ⅰ懸起細(xì)菌沉淀。

3．加入200ul前新配制的溶液II，顛倒EP管5次混合均勻，置冰浴2min。

4．加入150ul溶液III溫和地混勻，12000rpm/min,離心5min。

5．吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中，加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次，12000rpm/min，離心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP管中，加入二倍體積的冷乙醇，12000rpm/min，離心10min。

6．棄乙醇，干燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸，待電泳檢測(cè)。

二、瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（Agarosegelelectroghoresis）是分離、鑒定和提純DNA斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA段。瓊脂糖凝膠電泳是一個(gè)電場(chǎng)作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應(yīng)，此外，在弱堿性條件下，DNA分子帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。根據(jù)DNA分子大小、結(jié)構(gòu)及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過(guò)介質(zhì)運(yùn)動(dòng)而相互分離。借助溴化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結(jié)合的作用，利用EB染色，并通過(guò)紫外線激發(fā)即可觀察被分離DN段的位置。

材料

1．瓊脂糖、10×TAE電泳緩沖液（40mMTris，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）

2．載體緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，30%）、溴化乙錠水溶液（10mg/ml）

3．凝膠槽、電泳儀

方法

1．取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，100℃加熱溶解。

2．平衡凝膠槽，放好兩側(cè)擋板，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離（一般高出底板0.5~1mm）。

3．鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至50℃左右倒入凝膠槽，膠厚一般為5~8mm。

5．DNA樣品與載體緩沖液5：1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）。

6．打開電源，調(diào)節(jié)所需電壓，電壓與凝膠的長(zhǎng)度有關(guān)，一般使用電壓不超過(guò)5v/cm。

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4．待膠*凝固后，去掉兩側(cè)擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負(fù)，DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)），使液面高出凝膠2~3mm，小心拔出梳子。

．據(jù)指示染料移動(dòng)的位置，確定電泳是否終止（溴酚藍(lán)的涌動(dòng)距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間）。

8．電泳完畢關(guān)閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照。