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主要程序（1）抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復合物；（2）加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復合物；（3）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；（4）PCR擴增生物素化DNA部分。實驗步驟（1）制備生物素化DNA將噬粒BLuescriptskt,用生物素標記的M13引物進行PCR擴增制備出含T3和T7引物序列的280bpDNa段，即為生物素化DNA。（2）免疫PCR模式1.試劑包被緩沖液：20mmol/LTris-HCI（pH9.5），含150mmol/LNaC
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PCR技術專題：PCR擴增分離目的DNA段實驗原理、材料和步驟
一、目的了解多聚合酶鏈反應DNA擴增技術的基本原理和實驗應用，掌握PCR反應基本技術。二、原理PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應是1986年由KallisMullis發(fā)現(xiàn)。這項技術已廣泛地應用于分子生物學各個領域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構建，基因表達調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機制探查，法醫(yī)鑒定等方面。PCR技術已成為方法學上的一次革命，它必將大大推動分子生物學各學科的研究發(fā)展。PCR是一種 -
PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產(chǎn)物直接進行連接。載體可用EcoRV或SmaI切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的VentDNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴增出來的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以
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PCR技術專題：反向PCR （inverse-PCR）實驗步驟
inverse-PCR是克隆插入片段側翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽性太多，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段?；静襟E如下：1、反向PCR（InversePCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點側翼DNA序列非常有效的方法。a.選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點附近設計引物P1、P2；b.回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA段環(huán)化；c.回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就 -
菌落PCR標簽：菌落PCR菌落PCR（ColonyPCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進行重組體的篩選或者DNA測序分析。zui后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。實驗方法基本方案實驗方法原理直接挑取菌落進行PCR，PCR的95℃加熱可以破胞，釋放基因組DNA或質(zhì)粒，成為PCR體系的模板，然后進行鏈式擴增。實驗材料基因樣品試劑、試劑盒dNTPPCR混合液儀器、耗材PC
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巢式PCR標簽：巢式PCR巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應（PCR），使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。*對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在*次PCR擴增片段的內(nèi)部）結合在*次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于*次擴增。實驗方法基本方案實驗方法原理由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。由于第二套引
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PCR技術專題：限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析
本實驗將應用RFLP分析技術檢測NMDA受體中的GRIN2A亞基基因3號內(nèi)含子中的2個SNP位點rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。[實驗原理]DNA限制性內(nèi)切酶具有識別特定的DNA序列并在特定的部位切斷DNA雙鏈的活性功能，DNA分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識別序列，使DNA限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DN段切斷，電泳檢測時，存在相應DNA限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA片段變成短片段；不存在相應DNA限制性內(nèi)切酶識別序列者原DN -
PCR方法操作簡便，靈敏度高，可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應用于多種病原微生物的檢測。乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，在我國發(fā)病率很高，而且HBV與肝硬化、原發(fā)性肝癌關系密切，因此，HBV的診斷極為重要。PCR檢測HBV-DNA敏感性明顯高于傳統(tǒng)的血清學方法，且能顯示HBV在體內(nèi)復制情況，直接反映患者血液的感染性，并對模棱兩可的或與臨床表現(xiàn)不符的血清學結果，PCR技術有助于明確診斷?！静牧稀看龣z血清、HBV-PCR反應液20管（20μl/管）、HBV-DNA裂解液、陽性模
