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一、實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問題

1.  選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。

一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.  藥物濃度的設(shè)定。

一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。

3.  時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。

在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，zui后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的zui明顯）。

4.  培養(yǎng)時(shí)間。

200 ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4~5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68 h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48 h換液的。

5.  MTT法只能測定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測定細(xì)胞數(shù)。

做MTT時(shí)，盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。

6.  理論未必都是對(duì)的。

要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。

7.  實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。

調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8.  避免血清干擾。

用含15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）貼壁細(xì)胞

1.  收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.  5%CO₂，37 ℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度，每孔100 ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。

3.  5%CO₂，37 ℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5.  終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6.  每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。

7.  同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

（二）懸浮細(xì)胞

1.  收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲(chǔ)存液100 ug/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1：10-1：20）；③需檢測物10 ul；④細(xì)胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100 ul 1640）。

2.  置37 ℃，5%CO₂孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）

4.  離心（1000轉(zhuǎn)x10 min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。

5.  同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。