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原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及實驗方案
取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心臟，按改良的Lader方法進(jìn)行細(xì)胞的分離。 獲取博動的心臟迅速放置于無Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡液中。剪碎心臟，放置在4℃條件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h，用Trypsin抑制劑中止消化。然后在37℃下，用膠原酶Ⅱ于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在搖床上繼續(xù)孵化消化45~60 min，zui后用70 μm直徑尼龍過濾網(wǎng)過濾獲取心肌細(xì)胞，用含有25 mmol/L HCO3-，100 mL/L FSB，1×105 u/L青霉素G和50 g/L鏈霉素的M199培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按差速貼壁分離法純化心肌細(xì)胞。加入10 μmol/L BrdU到細(xì)胞懸液，以6×105密度種植于96或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng). 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞24 h后更換含有10 μmol/L BrdU新鮮M199培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行實驗使用. 設(shè)立陰性、陽性對照及實驗組，每組20孔；陽性對照加入4 μmol/L STS，實驗組中加入4 μmol/L STS后再分別加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB，100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h，更換新鮮M199培養(yǎng)基繼續(xù)孵化4 h后進(jìn)行各種指標(biāo)的檢測。
細(xì)胞存活試驗
按照實驗方案處理后的培養(yǎng)心肌細(xì)胞，每100 μL培養(yǎng)基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h，用分光比色儀進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率=A試驗組/A對照組×100%. MTT法A值既能反映心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性，又能間接反映心肌細(xì)胞的增殖與存活情況.
凋亡瓊脂糖凝膠電泳檢測
收集24孔板處理過的細(xì)胞，棄上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase細(xì)胞裂解液(10 μmol/L Tris.HCl，0.1 mol/L EDTA，5 g/L SDS)，37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K繼續(xù)孵化。1 h后加入等體積的酚、氯仿、異丙醇（25∶24∶1）充分搖勻，離心取上清再加入等體積的氯仿抽提1次，轉(zhuǎn)移的上清液中再加1/10體積3 mol/L醋酸鈉及兩倍體積的無水乙醇過后離心，700 mL/L的乙醇洗滌后，TE液溶解DNA，于20 g/L含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀下觀察、記錄拍照.
Caspase3活性的檢測
使用ApoONETM Homogeneous Caspase3試劑盒檢測Caspase3活性. 實驗設(shè)立空白、陰性對照及實驗組，含有100 μL培養(yǎng)基的實驗細(xì)胞中，加入100 μL的混合Caspase3底物ZDEVDR110和緩沖液，在室溫下輕微搖動孵化6~8 h，用熒光檢測儀于激發(fā)波為485 nm，散發(fā)波長538 nm處，讀取檢測熒光值.
心肌細(xì)胞膜完整性檢測
細(xì)胞培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測，LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。取細(xì)胞培養(yǎng)上清50 μL，反應(yīng)后490 nm處測A值。
