聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級會員·13年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
- 個性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機商鋪
甲基化檢測方法（亞硫酸氫鹽修飾后測序法）
甲基化是目前的研究熱點，就我所做的一點工作并其中一點心得，與大家分享。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?br />
*部分 基因組DNA的提取。
這一步?jīng)]有懸念，*可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。
此步重點在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細節(jié)：
1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶后進行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存。
驗證提取DNA的純度的方法有二：
1：紫外分光光度計計算OD比值；
2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
我傾向于第二種方法，這種方法*可以明確所提基因組DNA的純度，并根據(jù)Marker的上樣量估計其濃度，以用于下一步的修飾。
第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA
如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。
1：將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；
2：加5.5ul新鮮配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期間配制：
4：10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液變成淡黃色）
5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，zui終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準確為5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。
7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm開始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，時間上很合適。
這一步細節(jié)：
1：基因組DNA的量不需十分，寧多勿少，因為在以后純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾zui多可至4ug。
2：所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過關(guān)，既要快，又要。
3：亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會影響后續(xù)純化吸收。
4：水浴達16小時，雖可以短至8小時，但后者修飾會有不*。
