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實(shí)驗(yàn)原理

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究待許多領(lǐng)域。FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。

雜交所用的探針大致可以分類三類：1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如α衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信號強(qiáng)，易于檢測；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。
探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時(shí)步驟簡單，但由于不能進(jìn)行信號放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。

實(shí)驗(yàn)用具及材料

相關(guān)溶液的配制

1）20×SSC：175.3g NaCl，88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調(diào)pH 至7.0）。

2）去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，用Whatman l號濾紙濾。

3）體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。

4）體積分?jǐn)?shù)50％甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。

5）體積分?jǐn)?shù)50％硫酸葡聚糖（DS）：65oC水浴中融化，4oC或-20oC保存。

6）雜交液：8µL體積分?jǐn)?shù)25％DS，20µL 20×SSC混合。（或40µL體積分?jǐn)?shù)50％DS，20µL 20×SSC，40µL ddH2O混合）取上述混合液50µL，與5µL DF混合即成。其終濃度為體積分?jǐn)?shù)10％DS，2×SSC，體積分?jǐn)?shù)50％DF。

7）PI/antifade溶液

PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100µg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使終濃度為2.5µg/mL。Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL,用0.5mmol/L的NaHCO3調(diào)pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL，混勻。

PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1:9比例充分混勻，－20oC保存?zhèn)溆谩?

8）DAPI/antifade溶液：用去離子水配制1mL/mg DAPI儲存液，按體積比1:300，以antifade溶液稀釋成工作液。

9）封閉液I：體積分?jǐn)?shù)5％BSA 3mL，20×SSC 1mL,ddH2O 1mL,Tween20 5µL混合。

10）封閉液II：體積分?jǐn)?shù)5％ BSA 3mL,20×SSC 1mL,goat serum 250µL,ddH2O 750µL,Tween20 5µL混合。

11）熒光檢測試劑稀釋液：體積分?jǐn)?shù)5％ BSA 1mL，20×SSC 1mL,ddH2O 3mL,Tween20 5µL混合。

12）洗脫液：100mL 20×SSC，加水至500mL，加Tween20 500µL。

實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1）探針變性

將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

2）標(biāo)本變性

①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50oC培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。
      ②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75oC的體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。
      ③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70％、體積分?jǐn)?shù)90％和體積分?jǐn)?shù)100％冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。

3）雜交

將已變性或預(yù)退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。

4）洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

（1） 雜交次日，將標(biāo)本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
      （2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50oC的體積分?jǐn)?shù)50％甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。 
      （3） 在已預(yù)熱42～50oC的1×SSC中洗滌3次，每次5min。 
      （4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下。 
      （5） 取出玻片，自然干燥。 
      （6） 取200μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。

5）雜交信號的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）

（1） 在玻片的雜交部位加150μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37oC溫育20min。 
      （2） 去掉保鮮膜，再加150μL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37oC繼續(xù)溫育40min。 
      （3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50oC的洗脫液中洗滌3次，每次5min。 
      （4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加150μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37oC溫育20min。 
      （5） 去掉保鮮膜，加150μL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37oC溫育40min。 
      （6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50oC的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。 
      （7） 重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。 
      （8） 取出玻片，自然干燥。 
      （9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。

6）封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在—20～—70oC的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。

7）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。

所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長及濾光鏡選擇