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抗原修復(fù)技術(shù)在免疫組化中的應(yīng)用

2013-4-15　　閱讀(1638)

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福爾馬林固定時(shí)，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時(shí)，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當(dāng)部分的抗原不能與抗體很好是進(jìn)行反應(yīng)。因此，抗原修復(fù)也是影響免疫組化染色結(jié)果的基本因素。

     在傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法,經(jīng)脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧（化）物酶，石蠟切片經(jīng)蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘（注意防止切片干躁）。有時(shí)在加熱5分鐘后，間隔1分鐘，再加熱5分鐘（在*個(gè)5分鐘后檢測(cè)液體高度）。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘。片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進(jìn)行IHC染色。為了保持一致的加熱條件，必須設(shè)定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號(hào)的Coplin缸 ，按照不同的抗體設(shè)定不同的加熱時(shí)間，盡可能的建立標(biāo)準(zhǔn)的加熱條件。
     微波（MW）加熱過程如下：在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液（PH6.0±0.1），并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時(shí)采用微波爐中等功率800W[3]，微波爐選用解凍檔的國產(chǎn)家用微波爐（根據(jù)目前的研究,建議用醫(yī)用微波爐），中檔繼續(xù)處理10-20分鐘；取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘。
盡管有少數(shù)作者[4]認(rèn)為經(jīng)高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點(diǎn)，15分鐘的冷卻必須的幾點(diǎn)理由：1、如這一步省略，對(duì)于有些抗體而言，會(huì)降低AR-IHC染色強(qiáng)度。2、突然從高溫到低溫可導(dǎo)致組織片掉片。3、可能引起形態(tài)學(xué)的變化。
 
     抗原修復(fù)的方法選擇，關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對(duì)免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細(xì)胞間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化。工作中要認(rèn)真參照抗體說明書指示進(jìn)行消化酶的選擇，這樣針對(duì)性更強(qiáng)，標(biāo)記效果更理想。
   
     總之,以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩(wěn)定, 高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對(duì)修復(fù)效果無任何影響，而PH值則影響較大。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明，溫度高修復(fù)時(shí)間短[6]。解放軍第251醫(yī)院根據(jù)臨床病理診斷、鑒別診斷和研究的實(shí)際需要，在抗原修復(fù)方法規(guī)范研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)上，創(chuàng)用了胰蛋白酶—尿素聯(lián)合消化技術(shù)、鹽酸水解暴露抗原技術(shù)和MW—表面活性劑Triton X—100（MW—TX）修復(fù)抗原技術(shù) [7] ?？乖┞痘蚩乖迯?fù)方法較多，其中發(fā)MW—枸櫞酸緩沖液使用較多，效果。MW修復(fù)抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗后放入修復(fù)液中，用250W的輸出功率2X5min，待冷卻至室溫按常規(guī)處理。目前AR過程已成功應(yīng)用在BioTek全自動(dòng)免疫組化染色儀中。
     加熱持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度是重要的影響因素之一，AR液的PH值、濃度、化學(xué)成分也是重要的影響因素之一。使用低PH值A(chǔ)R液必須使用陰性對(duì)照片，以防止定位不準(zhǔn)[9]。Shi等人[10]強(qiáng)調(diào)修復(fù)緩沖液的PH值對(duì)某些抗原的修復(fù)十分重要,實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)要獲得滿意結(jié)果必須選擇抗原修復(fù)液的zui適PH值。在常規(guī)石蠟切片做AR-IHC，采用不同濃度的Alcl3液做AR液，發(fā)現(xiàn)4%的Alcl3取得的染色[11]。在修復(fù)的抗原中，金屬鹽可影響蛋白的結(jié)構(gòu)。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩沖液、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修復(fù)抗原，發(fā)現(xiàn)其陽性強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。
     高溫抗原修復(fù)因其機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，對(duì)某些存在的問題很難用設(shè)計(jì)對(duì)照的方法加以解決，有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但在石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好的顯示。對(duì)某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或表達(dá)在核內(nèi)的抗原，經(jīng)過量修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)過量修復(fù)會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用該方法時(shí)一定小心，對(duì)結(jié)果的判斷也要客觀地作出分析，侯寧等人發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TRT）經(jīng)過抗原修復(fù)與不經(jīng)過抗原修復(fù)，其染色效果明顯不同，后者的陽性率明顯高于前者[8]。
     用于IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時(shí)間及溫度等均要視組織固定的不同，所檢測(cè)抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶則主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的檢測(cè)，如fibronectin，Laminin，各型膠原等。一般來言，消化時(shí)間和組織固定的長(zhǎng)短呈正比。在用酶消化，熱修復(fù)后均不能獲得結(jié)果的前提下使用抗原修復(fù)與酶消化結(jié)合的方法，有時(shí)會(huì)取得較為滿意的結(jié)果。一般蛋白酶K和微波相結(jié)合，但應(yīng)注意，可能檢測(cè)的抗原無論何種性質(zhì)均會(huì)在核內(nèi)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)[6]。
     上個(gè)世紀(jì)九十年代早期，隨著AR技術(shù)的發(fā)展，IHC應(yīng)用在常規(guī)處理火膠棉包埋的人類顳骨上，從分子水平上了解人類發(fā)病機(jī)理和病理生理學(xué)，創(chuàng)立了一個(gè)新的領(lǐng)域[13]。使用AR方法，在常規(guī)處理石蠟切片上評(píng)估IC5和ID15單克隆抗體的免疫組化染色[14]。 Charalambous. C等人 [15]強(qiáng)烈推薦MW-AR-IHC方法檢測(cè)R-S細(xì)胞的CD30。AR技術(shù)成功應(yīng)用于原位雜交[16]。利用加熱AR-IHC技術(shù)，在福爾馬林固定、石蠟組織切片上用抗毒素#4350檢測(cè)nestin[17]。采用抗復(fù)技術(shù)，在人類上皮、神經(jīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌組織中免疫組化定位DCC蛋白[18]。AR-IHC已廣泛應(yīng)用于臨床的研究中。
     診斷IHC上的AR技術(shù)及其在基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究已被為數(shù)眾多的文獻(xiàn)和比較多的綜述所闡述。此領(lǐng)域的調(diào)查目的：從分子生物學(xué)診斷常規(guī)上，在石蠟組織中檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)新途徑的可能性，從而形成新興的分子形態(tài)學(xué)。一些新的途徑必須建立標(biāo)準(zhǔn)化的原則和提高其重復(fù)性。[19] 。目前我國病理科大多數(shù)醫(yī)院病理科尚未在IHC、AR上標(biāo)準(zhǔn)化，國外已廣泛進(jìn)行進(jìn)行AR的標(biāo)準(zhǔn)化及IHC標(biāo)準(zhǔn)化[20]。例如在建立新的修復(fù)液方面，針對(duì)不同的抗體預(yù)定義加熱條件和液體濃度、PH值、化學(xué)成分，從而推動(dòng)AR的標(biāo)準(zhǔn)化。
   

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