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枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)

2013-3-2　　閱讀(2221)

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標(biāo)簽： 枯草芽孢桿菌 感受態(tài)細(xì)胞 制備

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備可以：（1）用于建立枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系；（2）用于其基因改造；（3）用于提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)性能相關(guān)研究。

實(shí)驗(yàn)方法
  • 化學(xué)法
  • 化學(xué)改進(jìn)法
實(shí)驗(yàn)材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑配制

1.  SP 鹽

0.2%（ NH4 ）2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 檸檬酸鈉。
 
2.  CAYE （100×）

2 % Casamino acid，10%酵母膏。
 
3.  SPI 培養(yǎng)基

SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。

4.  SPII 培養(yǎng)基

SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl2 溶液。
 
5.  SP-A Salts Solution（500 ml） 

（1）0.4% （NH4）2SO4 ：2 g

（2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g

（3）1.2% KH2PO4 ：6 g

（4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g

（5）121°C滅菌20 min。
 
6.  SP-B Salts Solution（500 ml）

（1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g

（2）121°C滅菌20 min。
 
7.  100×CAYE Solution（100 ml）
 
（1）2% Casamino acid ：2 g

（2）10% Yeast Extract：10 g 

（3）121°C滅菌20 min。
 
8.  SPI Medium（20 mL）

 SP-A Salts Solution：9.8 mL

 SP-B Salts Solution：9.8 mL

 （1%V）Glucose（50%w/v，115°C滅菌20 min） ：200 μL

 （1%V）100×CAYE：200 μL
 
10.  SPII Medium（6 mL）

SPI Medium：5.88mL

（1%V）50mM CaCl2 ：60μL

（1%V）250mM MgCl2：60μL
 
11.  100×EGTA Solution

10mmol/L EGTA 溶液，溶解時(shí)需加少量NaOH 至pH8.0。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.  準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。
 
2.  轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜。
 
3.  第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（168 約4-5 h）。
 
4.  取0.2 ml 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。
 
5.  在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。
 
6.  將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA（DNA 量不能過(guò)高，不超過(guò)5 μg），再于37 °C，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。
 
 
 
 
 
收起 
注意事項(xiàng)
1.  注意儀器用品的干凈和無(wú)菌。

2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，不要使用玻璃試管。

3. 注意測(cè)定OD值，一定要等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期。

4. 保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。
 
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