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PCR技術(shù)可用于：（1）檢驗(yàn)感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)；（2）有效檢測(cè)癌基因的突變，準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量；（3）臨床應(yīng)用于檢測(cè)地中海貧血的基因突變。
實(shí)驗(yàn)方法
- PCR技術(shù)
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： ①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備； ②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； ③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 展開 |
| 注意事項(xiàng) | 1. 由于PCR反應(yīng)靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中。 2. 如果是公用的、沒有密碼保護(hù)的PCR儀，經(jīng)常檢查PCR儀上的程序正確與否。 3. 不使用過量試劑“less is usually better （more specific）”。 4. 試劑購回后應(yīng)分裝成小份使用，這樣一旦有污染發(fā)生，可以立即丟棄污染的試劑，不會(huì)造成大的損失；試劑分裝也有助于減少反復(fù)凍融次數(shù)（例如dNTPs對(duì)反復(fù)凍融敏感）。 5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。 6. 使用陰性對(duì)照檢查污染的發(fā)生。 7. 使用陽性對(duì)照（能良好擴(kuò)增的樣本）。 8. 電泳時(shí)使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失?。?。 9. 當(dāng)擴(kuò)增很長(zhǎng)的、GC含量高的模板時(shí)或容易產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板時(shí)適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用；DMSO 減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的發(fā)生，并通過減弱非特異性引物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的特異性）。 10. 不使用帶有自動(dòng)除霜功能的冰箱存儲(chǔ)酶（避免反復(fù)凍融），每次取酶時(shí)都使用新的槍頭酶，酶使用后應(yīng)立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導(dǎo)致酶變性失活。 11. PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間，一般為48 h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。 |
| 其他 | 一、 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 1. 模板核酸的制備。 2. 引物的質(zhì)量與特異性。 3. 酶的質(zhì)量。 4. PCR循環(huán)條件。 二、 PCR常見問題及對(duì)策 1. 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 （1）模板原因 ① 模板中含有雜蛋白質(zhì)。 ② 模板中含有Taq酶抑制劑。 ③ 模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。 ④ 在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。 ⑤ 模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。 （2）酶失活 ① 需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。 ② 忘加Taq酶或溴乙錠。 （3）引物 ① 引物質(zhì)量。 ② 引物的濃度。 ③ 兩條引物的濃度是否對(duì)稱。 解決對(duì)策： ① 選定一個(gè)好的引物合成單 位。 ② 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。 ③ 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 ④ 引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 （4）Mg2+濃度 ① 濃度過高降低PCR擴(kuò)增的特異性。 ② 濃度過低影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 （5）反應(yīng)體積的改變 ① 通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定; ② 在做小體積如20 ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 （6）物理原因 ① 變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。 ② 退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。 ③ 擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題。 （7）靶序列變異 ① 靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。 ② 靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列。 2. 假陽性，出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 （1）引物設(shè)計(jì)不合適 ① 選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性。 ② 靶序列太短或引物太短。 （2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 ① 整個(gè)基因組或大片段的交叉污染。 解決方案：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 ② 空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。 解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除。 3. 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。 （1） 引物與靶序列不*互補(bǔ)或引物聚合形成二聚體。 （2） Mg2+離子濃度過高。 （3） 退火溫度過低。 （4） PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。 （5） 酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。 4. 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 （1）原因 ① 酶量過多。 ② 酶的質(zhì)量差。 ③ dNTP濃度過高。 ④ Mg2+濃度過高。 ⑤ 退火溫度過低。 ⑥ 循環(huán)次數(shù)過多引起。 （2）對(duì)策 ① 減少酶量。 ② 調(diào)換另一來源的酶。 ③ 減少dNTP的濃度。 ④ 適當(dāng)降低Mg2+濃度。 ⑤ 增加模板量。 ⑥ 減少循環(huán)次數(shù)。 |
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實(shí)驗(yàn)心得
wsgcc: 空質(zhì)粒ppiczA電轉(zhuǎn)GS115后PCR篩選遇難題
我想有300多bp的片段出現(xiàn)，說明酵母細(xì)胞已經(jīng)破碎（用的溶細(xì)胞酶），奇怪的是2.2KB的條帶去哪里了？是PCR假陰性呢，還是菌落都是假陰性呢？唉!本來準(zhǔn)備篩選出來好好過五一，看來計(jì)劃趕不上變化了。各位老師，請(qǐng)幫幫我吧!不勝感激！
發(fā)表于2005-11-17
一天P幾百管的人可能不用擔(dān)心條帶有沒有，而對(duì)于剛?cè)腴T分子生物學(xué)的人來說，PCR能看到條帶，能看到一條明亮的帶就是入門zui大的欣慰。師姐會(huì)告訴你，引物設(shè)計(jì)很重要，不能有二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)；師兄也會(huì)和你說退火溫度很重要。提高PCR特異性可謂是仁者見仁，智者見智。搜集了丁香園里網(wǎng)友們的討論，精華匯總?cè)缦隆?/p>
發(fā)表于2006-07-13 10:50
sinviolet: 質(zhì)粒載體能否做PCR進(jìn)行擴(kuò)增？
首先，要看你的載體是環(huán)狀的（如ET32a）還是線性的（如pMD-T）.要是環(huán)狀的就找合適的宿主轉(zhuǎn)化再提出來就可以持續(xù)用了。要是線性的就不能這樣做了。PCR的話首先要合成引物，還不能保證高保真性好，要確認(rèn)的話還要測(cè)序，所以總的下來從時(shí)間和經(jīng)濟(jì)上考慮是不劃算的。
發(fā)表于2007-04-28 20:42
