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原創(chuàng) 飛飛 賽默飛色譜與質(zhì)譜中國(guó)

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二維液相色譜技術(shù)

二維液相色譜分離技術(shù)是利用兩根性質(zhì)不同的色譜柱對(duì)復(fù)雜樣品中的待分析組分進(jìn)行分離。不同的液相色譜模式如排阻色譜（SEC）、親和色譜、離子交換色譜（IEC）、疏水作用色譜（HIC）、反相色譜（RP）等都可以用來(lái)組合、構(gòu)建二維液相色譜。

近年來(lái)二維液相色譜分離技術(shù)被廣泛應(yīng)用于抗體藥物領(lǐng)域。中心切割二維液相方法和全二維液相方法的工作流程用于指導(dǎo)抗體藥和生物類似藥研發(fā)過(guò)程中的單克隆篩選。一維使用親和色譜方法，二維使用排阻色譜（SEC）、陽(yáng)離子交換（CEX）或反相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可以評(píng)估抗體的滴度、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征比如聚集體、片段、電荷異質(zhì)體、分子量、氨基酸序列和糖基化[1]。Yi Li[2]等人利用中心切割二維液相方法分析ADC藥物中的未偶聯(lián)小分子相關(guān)雜質(zhì)，該方法的一維是排阻色譜（SEC），將ADC藥物和未偶聯(lián)小分子相關(guān)雜質(zhì)分離開；然后使用中心切割的方式，將一維的未偶聯(lián)小分子相關(guān)雜質(zhì)切割到第二維反相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，進(jìn)行在線除鹽、未偶聯(lián)小分子相關(guān)雜質(zhì)鑒定并測(cè)定含量，3種未偶聯(lián)小分子相關(guān)雜質(zhì)的線性均為0.9999，回收率在95%-105%。

抗體藥Actemra

Actemra（托珠單抗）是重組人源化IgG1抗體，是人源化白細(xì)胞介素6（IL-6）受體拮抗劑。Actemra用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等。

圖1.托珠單抗Actemra（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，如涉及侵權(quán)，請(qǐng)告知，立刪）

SEC-RP串聯(lián)質(zhì)譜的二維液相色譜

高效表征Actemra

本實(shí)驗(yàn)一維使用排阻色譜法（SEC）測(cè)定抗體藥Actemra的聚集體、主峰、片段含量。因?yàn)橐痪S使用流動(dòng)相是質(zhì)譜不兼容的鹽，所以將一維的各個(gè)峰進(jìn)行中心切割，切到loop環(huán)中，然后使用二維質(zhì)譜兼容的流動(dòng)相將loop環(huán)中的餾分沖到二維反相色譜柱中進(jìn)行除鹽并將目標(biāo)物洗脫進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

01

儀器配置：

· Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex 系列液相色譜

· Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 質(zhì)譜儀

· Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ 軟件

02

一維色譜條件：

分析柱：SEC色譜柱

柱溫：室溫

進(jìn)樣量：2 µl

流速：0.15 mL/min

流動(dòng)相：100 mM PB+100 mM NaCl，pH7；等度

紫外檢測(cè)器：280 nm

03

二維色譜條件：

分析柱：MAbPac™ RP（2.1 X 50 mm）

柱溫：60℃

紫外檢測(cè)器：280 nm

流動(dòng)相：流動(dòng)相A：0.1%FA-H2O；流動(dòng)相B：0.1%FA-ACN；

流動(dòng)相梯度表：見(jiàn)圖2

圖2.二維流動(dòng)相梯度表

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04

質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：

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實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

抗體藥Actemra的SEC-HPLC的譜圖見(jiàn)圖3，該樣品主峰含量97.0%，片段1含量2.0%，片段2含量0.2%。以上含量按峰面積百分比進(jìn)行計(jì)算的。

圖3. 抗體藥Actemra的SEC-HPLC譜圖

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根據(jù)目標(biāo)峰的峰保留時(shí)間對(duì)2位6通閥進(jìn)行閥切換。主峰選擇7.0-7.5min時(shí)間段切到250 μL的loop環(huán)中，片段1選擇7.5-8min時(shí)間段切到250 μL的loop環(huán)中，片段2選擇8.7-9.2min時(shí)間段切到250 μL的loop環(huán)中。主峰的去卷積結(jié)果見(jiàn)圖4，根據(jù)已知氨基酸序列進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到相應(yīng)的分子量和對(duì)應(yīng)糖型修飾。片段1的去卷積結(jié)果見(jiàn)圖5，該片段的分子量約為100 KD，推測(cè)是兩條重鏈組成，具體的還需通過(guò)肽圖做進(jìn)一步鑒定。另外片段1去卷積后相鄰分子量均相差約162 Da（除100551 Da之外），推測(cè)是相差一個(gè)糖修飾。片段2的總離子流圖、去卷積結(jié)果圖和原始質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6-8，盡管片段2含量只有0.2%，利用二維液相的方法，在線中心切割到第2維反相，保留時(shí)間為19.382min，總離子流圖的響應(yīng)強(qiáng)度有2.7E8，在當(dāng)前質(zhì)譜儀器上有很好的響應(yīng)，完全可以進(jìn)行在線檢測(cè)。片段2的分子量約為47 KD，具體的還需通過(guò)肽圖做進(jìn)一步鑒定。

圖4.主峰的去卷積譜圖

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圖5.片段1的去卷積譜圖

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圖6.片段2的總離子流圖

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圖7.片段2的原始質(zhì)譜圖

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圖8.片段2的去卷積譜圖

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結(jié)論：

通過(guò)一維排阻色譜法（SEC）分離抗體藥Actemra的聚集體、主峰、片段；通過(guò)二維反相色譜柱進(jìn)行除鹽并將目標(biāo)物洗脫進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)鑒定，該方法可以快速獲得抗體藥物的聚集體、主峰、片段的含量，同時(shí)除掉一維的鹽并可以獲得抗體藥物各峰的分子量和相應(yīng)糖型修飾。該方法適用于抗體藥物研發(fā)的單克隆篩選及后續(xù)穩(wěn)定性研究質(zhì)控中。

參考文獻(xiàn)：

[1] Koen Sandra,Mieke Steenbeke,Isabel Vandenheede,et al.The versatility of heart-cutting and comprehensive two-dimensional liquid chromatography in monoclonal antibody clone selection.Journal of Chromatography A,2017.

[2] Yi Li,Christine Gu,Jason Gruenhagen,et al.A size exclusion-reversed phase two dimensional-liquid chromatography methodology for stability and small molecule related species in antibody drug conjugates. Journal of Chromatography A,2015,81-88.

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