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今天與大家分享一篇發(fā)表于Cell子刊Cell Reports雜志上的文章，通訊作者為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的大師，來自德國慕尼黑工業(yè)大學(xué)的Bernhard Kuster教授；

主要內(nèi)容為基于質(zhì)譜的經(jīng)典蛋白質(zhì)組學(xué)和翻譯后修飾組學(xué)分析干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞發(fā)育過程中蛋白的變化及階段性生物標(biāo)志物的研究。

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圖1：實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計及iPSCs分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞過程概述

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為了便于閱讀，我們首先對文章中的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行簡介：

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞( human induced pluripotent stem cells, iPSCs)為重編程體細(xì)胞，具有無限繁殖能力，其多能性使得經(jīng)誘導(dǎo)，分化為定型內(nèi)胚層(definitive endoderm ,DE)、肝內(nèi)胚層(hepatic endodermal ,HE)、未成熟肝細(xì)胞（immature hepatocyte, IH）、肝細(xì)胞樣細(xì)胞(hepatocyte-like cells，MH),分化過程如圖1所示。具體為通過誘導(dǎo)分化，在對應(yīng)的在不同時間點(diǎn)收取細(xì)胞，0天 iPSC細(xì)胞, 第6天 DE階段細(xì)胞, 第8天 HE階段細(xì)胞, 第13 天IH階段細(xì)胞以及第 21天 MH階段細(xì)胞。成人及胎肝細(xì)胞則由分離獲得。

肝細(xì)胞是肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，負(fù)責(zé)執(zhí)行大多數(shù)的肝臟的功能。肝臟還負(fù)擔(dān)了重要的外源物質(zhì)的解毒的作用，使得肝細(xì)胞在藥物的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中，原代人肝細(xì)胞(Primary human hepatocytes, PHHs)更是評估藥物代謝和毒性的金標(biāo)準(zhǔn)，但受限于材料短缺、在體外培養(yǎng)過程中的潛在變化以及捐獻(xiàn)者之間的高度異質(zhì)性等問題。故經(jīng)iPSCs分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞可作為替代方案，成為藥物評估等實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)容器，因此對iPSCs分化過程的研究至關(guān)重要。

我們知道，蛋白是生命活動的執(zhí)行者，翻譯后修飾更是具有極其高效的、物美價廉的調(diào)節(jié)作用。本篇文章中，作者使用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)作為研究工具，分析誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的分子過程，共鑒定到約9000個蛋白以及12000個磷酸化位點(diǎn)和800個乙?；稽c(diǎn)，如圖2所示。

基于獲得的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了在干細(xì)胞的分化過程中的一系列階段特異性的標(biāo)志物蛋白。該研究構(gòu)建了肝細(xì)胞發(fā)育過程分子路線圖，對iPSCs的分化路徑進(jìn)行深度解析，為未來相關(guān)研究提供寶貴數(shù)據(jù)資源。本篇文章內(nèi)容豐富詳實(shí)，分析全面，也是挖掘組學(xué)數(shù)據(jù)的經(jīng)dian范例。

圖2：蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程概述

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具體來說，在時間維度分辨的iPSCs到肝細(xì)胞的分化過程的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，作者使用了TMT標(biāo)記的策略，并使用TMT SPS-MS3的采集策略，獲得了肝細(xì)胞分化過程中的全面蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。共鑒定到約9000個蛋白以及12000個磷酸化位點(diǎn)和800個乙?；稽c(diǎn)。本組數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)異，其蛋白及修飾位點(diǎn)鑒定定量重復(fù)性高，并從PCA圖可看到，蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)重現(xiàn)了分化過程中的細(xì)胞轉(zhuǎn)變；而轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)的關(guān)系較弱，而比較有趣的是，蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平zui相關(guān)的階段是在分化上相距最遠(yuǎn)的兩個階段（iPSC和MH），這也說明mRNA數(shù)據(jù)不足以研究細(xì)胞在分化過程中的時間動態(tài)變化。而蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)揭示動態(tài)變化明顯更加得心應(yīng)手。

將在分化過程中的差異蛋白水平數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共計4956個蛋白，可被區(qū)分為10個聚類，有趣的是，TCA循環(huán)中的所有檢測到的13種蛋白，協(xié)同上調(diào)；琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDHA/B)的上調(diào)變化以及多種呼吸酶的表達(dá)量上調(diào)，連接了TCA循環(huán)和呼吸鏈，表明細(xì)胞代謝在IH階段中轉(zhuǎn)換到了氧化磷酸化。另一個被富集的通路是過氧化物酶體代謝途徑，其在脂肪酸代謝中具有關(guān)鍵作用，轉(zhuǎn)錄因子PPARα的上調(diào)表達(dá)，在細(xì)胞從HE到IH階段的代謝轉(zhuǎn)換中起到重要作用。

圖3：時間維度的代謝轉(zhuǎn)換

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在細(xì)胞周期的調(diào)控中，磷酸化調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，且其變化會優(yōu)先于蛋白水平。從iPSC到DE的轉(zhuǎn)化中，RB1-S807/811 和 CDK1-T161磷酸化水平均降低，提示說明早期的翻譯后修飾調(diào)節(jié)通過抑制G1/S和G2/M檢查點(diǎn)來進(jìn)行的。因?yàn)檫^度磷酸化的RB1無法結(jié)合調(diào)控G1/S進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄因子E2F，而未磷酸化的蛋白可以結(jié)合E2F，從而阻止細(xì)胞周期。G2/M檢查點(diǎn)是細(xì)胞周期的第二個關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)，主要由CDK1控制。CDK1的主要的周期蛋白CCNB1的水平在iPSC和DE之間顯著降低，在分化過程中大量已知和預(yù)測的CDK1底物的磷酸化水平也均降低。

圖4：蛋白表達(dá)量及磷酸化水平變化調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程

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在iPSC分化過程中，將表達(dá)的蛋白根據(jù)不同的生物學(xué)功能進(jìn)行區(qū)分。位于細(xì)胞表面的蛋白的表達(dá)量隨著分化時間的推進(jìn)而升高，特別是作為“細(xì)胞表面"蛋白的子集的溶酶體蛋白的表達(dá)量明顯隨著分化進(jìn)程升高。蛋白質(zhì)組學(xué)中觀察到的諸多“非規(guī)范的"功能變化，都反映了溶酶體是分化過程中的重要細(xì)胞器，共鑒定到726種細(xì)胞表面蛋白，其中97種都在分化過程中發(fā)生了量的變化；這些蛋白的變化趨勢，未來可能可以為控制細(xì)胞分化進(jìn)程或純化特定細(xì)胞群體的研究提供幫助。

在不同分化階段時間維度的組學(xué)分析中，作者以兩倍差異作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選到了共計78個階段性的差異表達(dá)蛋白，這些蛋白可以作為將來研究分化過程的起點(diǎn)。大多數(shù)標(biāo)志物主要來源于起始分化的iPSCs或者終末的MHs，而處于分化中間階段的標(biāo)志物蛋白發(fā)現(xiàn)較少，這個主要由于細(xì)胞的異質(zhì)性，目前的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)方式較難進(jìn)行分析。長鏈脂肪酸生物合成中的速率限制酶ACACA是iPSCs階段的標(biāo)志性蛋白之一，代表了這一時期的脂肪酸合成升高的事件。而在DE階段急劇下降的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B，這是細(xì)胞維持甲基化所必須的。而對于越過iPSCs階段后，蛋白DNMT3A的延長表達(dá)則能表明其在肝細(xì)胞分化中的特殊作用。組學(xué)數(shù)據(jù)表明，E-cadherin表達(dá)水平降低，間充質(zhì)標(biāo)記物則表達(dá)水平上升，說明細(xì)胞從iPSCs經(jīng)EMT后再向DE階段發(fā)展。與癌癥表型相關(guān)聯(lián)的GAB2蛋白同時也是DE階段的標(biāo)志物蛋白。ESRRG則是wei一在HE階段特異性和高表達(dá)的蛋白，在生物體發(fā)育中起到特定的作用。對于大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄因子，則會在細(xì)胞逐漸成熟時減少，且在HE到IH階段之間尤為顯著。對于MH階段來說，找到的78個階段性差異蛋白中，有52個是MH階段特異的；且有19個蛋白與免疫功能相關(guān)，這也與肝臟的免疫功能相對應(yīng)。如在尿素循環(huán)中第一步的酶CPS1，在MH階段上調(diào)16倍，而這可能跟肝臟的排毒功能對對應(yīng)。

圖5：時間維度分析中的標(biāo)志物蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的變化趨勢（點(diǎn)擊查看大圖）

Wnt通路是一個在進(jìn)化上高度保守的經(jīng)典的信號通路，調(diào)控細(xì)胞周期、影響細(xì)胞分化。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)，Wnt通路在iPSC分化中至關(guān)重要。組學(xué)數(shù)據(jù)揭示了多種Wnt信號調(diào)控因子的表達(dá)變化，包括標(biāo)記蛋白在所有階段的表達(dá)變化。如Wnt受體FZD5是DE期的階段特異性標(biāo)志物。而在DE期之后的HE階段，F(xiàn)ZD5再次下調(diào)，而抑制Wnt的ESRRG 和WNT11上調(diào)，表明Wnt信號在進(jìn)一步的肝細(xì)胞成熟過程中不會持續(xù)。除了Wnt通路外，數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)了多個與肝細(xì)胞分化相關(guān)的已知和必要信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)的顯著變化。

圖6：Wnt通路相關(guān)蛋白的變化及與肝細(xì)胞分化相關(guān)的顯著變化的通路

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與傳統(tǒng)的單層細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，3D培養(yǎng)的細(xì)胞可以更加貼合于細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，保持細(xì)胞間的相互作用，更好的模擬細(xì)胞的生理生化反應(yīng)，使得細(xì)胞對體內(nèi)外的刺激能有更接近于體內(nèi)的應(yīng)答。用來源于iPSC的HE期細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞組成的器官樣結(jié)構(gòu)，來研究2D培養(yǎng)及3D體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞與胎肝及原發(fā)性人肝細(xì)胞（Primary human hepatocytes, PHH）（它是研究乙肝病毒感染的經(jīng)典體外感染模型）之間的異同。

作者同樣對其進(jìn)行了深度蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，共鑒定到8800個蛋白和12700個磷酸化位點(diǎn)。如PCA分析結(jié)果可得，幾種不同的材料的數(shù)據(jù)可清晰分開，展示了肝細(xì)胞在體內(nèi)的成熟過程。與其他的任何器官相比，2D和3D的培養(yǎng)的細(xì)胞的階段特異性標(biāo)記蛋白都更為接近人肝臟組織，且3D細(xì)胞的標(biāo)記蛋白對此更加特異。而對于體內(nèi)外數(shù)據(jù)與PHH的比較中，數(shù)據(jù)層面不管是選取強(qiáng)度前25個蛋白或者是表達(dá)量最高的1000個蛋白，從2D培養(yǎng)到3D培養(yǎng)到胎肝，其差異均呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，證實(shí)3D培養(yǎng)的細(xì)胞在分子層面確實(shí)更加接近于真實(shí)的胎肝或成人肝臟細(xì)胞。另一方面，藥物的“吸收-分布-代謝-排泄-毒性" 藥物動力學(xué)方法，對評估生物活性化合物能否被開發(fā)為治療藥物至關(guān)重要，所以也應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)對此方面進(jìn)行了解析。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)與此相關(guān)的蛋白僅在PHH中呈現(xiàn)高表達(dá)，數(shù)據(jù)表明，在特定的蛋白表達(dá)量上，不論是2D還是3D培養(yǎng)的由iPSC衍生的肝細(xì)胞的蛋白表達(dá)與PHH均有差別。

圖7：不同培養(yǎng)模式肝細(xì)胞的比較分析

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結(jié)語 /conclusion/

對于發(fā)育生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)來說，細(xì)胞如何變得特化或“成熟"的機(jī)制很重要。這篇文章，為我們地圖式的展示了干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞發(fā)育過程中蛋白表達(dá)及翻譯后修飾水平的變化，并對組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了詳盡的分析與挖掘，并與前人的一些工作進(jìn)行整合分析、比對，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了很好的分析利用，將蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化與與細(xì)胞所處的時期、發(fā)揮的功能進(jìn)行聯(lián)系，為將來更深入的細(xì)胞分化機(jī)理研究打下基礎(chǔ)。在蛋白質(zhì)組學(xué)及翻譯后修飾組的研究中，我們可以得到在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中無法得到的信息；數(shù)據(jù)中還給到了隨著分化過程的時間特異的標(biāo)志物蛋白等一系列信息，希望這些數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步用于開發(fā)改進(jìn)細(xì)胞的分化方案。

就本文來說，肝臟細(xì)胞的來源短缺以及肝組織體外模型的缺失嚴(yán)重制約了藥物篩選及毒理研究，我們希望尋找更好的替代方案；組學(xué)數(shù)據(jù)表明，雖然3D培養(yǎng)略好，但于我們現(xiàn)在應(yīng)用的細(xì)胞模型與真實(shí)的細(xì)胞環(huán)境之前還有很大差別，這也為將來的如藥物評估等研究提出了疑問與更高的要求。

目前，基于質(zhì)譜的經(jīng)典的定量蛋白質(zhì)組學(xué)及翻譯后修飾組學(xué)，走向了復(fù)雜的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。相關(guān)研究包括類器官等相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也多了起來，包括對揭示SARS-CoV-2感染機(jī)制等類器官相關(guān)文獻(xiàn)也多有報道；類器官能夠高度模擬體內(nèi)環(huán)境，并在體外能夠真實(shí)的展現(xiàn)器官的結(jié)構(gòu)和功能，目前類器官在構(gòu)建應(yīng)用于藥物敏感性研究或者疾病分子機(jī)理蓬勃發(fā)展，我們也希望技術(shù)的發(fā)展能為更多的生物學(xué)研究，甚至體外再造組織、器官等提供更多的幫助。

參考文獻(xiàn)

[1] Krumm J, Sekine K, Samaras P, Brazovskaja A, Breunig M, Yasui R, Kleger A, Taniguchi H, Wilhelm M, Treutlein B, Camp JG, Kuster B. High temporal resolution proteome and phosphoproteome profiling of stem cell-derived hepatocyte development. Cell Rep. 2022 Mar 29;38(13):110604. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110604. PMID: 35354033.

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