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純干貨!代謝流驗(yàn)證哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的嘌呤合成途徑!

閱讀:229      發(fā)布時(shí)間:2022-8-24
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哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程復(fù)雜,其代謝物的調(diào)節(jié)及機(jī)制是動(dòng)態(tài)且極其精細(xì)的。在妊娠中期時(shí),隨著胚胎器官的發(fā)育,耗氧量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求均顯著增加,代謝活動(dòng)更為旺盛,而了解這些代謝過(guò)程對(duì)于胚胎發(fā)育的作用和影響至為重要。

Nature在四月的正刊發(fā)表了美國(guó)德克薩斯州立大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心DeBerardinis教授課題組的研究[1],該研究使用代謝組學(xué)的方法以完整胚胎-胎盤(pán)為單位對(duì)于小鼠妊娠中期胚胎中的代謝進(jìn)行了研究,揭示了妊娠中期胚胎和胎盤(pán)的代謝特征,并借助同位素標(biāo)記示蹤技術(shù),對(duì)其中的碳水化合物代謝途徑的差異和嘌呤的生物體內(nèi)快速合成進(jìn)行了探索,為妊娠中期胚胎發(fā)育及胎盤(pán)營(yíng)養(yǎng)的代謝機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。

\  代謝途徑變化分析

妊娠中期是胚胎發(fā)育、胎盤(pán)及代謝變化非常明顯的階段,在這段發(fā)育過(guò)程中,胚胎和胎盤(pán)重量快速增加,心臟、大腦和肝臟等器官迅速發(fā)育,并伴隨耗氧量的增加及代謝物的輪廓?jiǎng)×也▌?dòng)。

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在小鼠的妊娠過(guò)程中,胎盤(pán)于妊娠3.5天形成,到9.5天時(shí)可同胚胎分離,其妊娠中期(GD10.5~13.5)的胎盤(pán)及胚胎重量、代謝物輪廓熱圖及代謝物種類(lèi)均有明顯變化。由于胚胎和胎盤(pán)的細(xì)胞組成和功能差異很大,所以?xún)煞N組織的代謝輪廓在整個(gè)妊娠中期的差異也非常明顯,基于LC-Orbitrap MS的代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示在GD10.5到11.5之間的波動(dòng)尤為明顯(見(jiàn)下圖),提示這段時(shí)間的代謝途徑變化非常劇烈。通過(guò)代謝通路富集分析及差異代謝物的對(duì)比,鎖定嘌呤和嘧啶代謝為胚胎中最重要的代謝變化,大部分嘌呤在GD10.5后持續(xù)增加,而嘧啶的量維持平穩(wěn),故針對(duì)嘌呤的體內(nèi)合成進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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\  嘌呤合成過(guò)程研究

眾所周zhi,嘌呤在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的合成有兩種方式,從頭合成(de novo synthesis)[2]或補(bǔ)救合成(salvage synthesis)[3]。

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針對(duì)嘌呤的生物合成過(guò)程,使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法進(jìn)行了研究。在GD10.5時(shí)將[13C]葡萄糖注入懷孕的小鼠,在保持血流供應(yīng)的情況下,并每隔30 min取其血、胚胎及對(duì)應(yīng)胎盤(pán),對(duì)代謝物及其[13C]同位素標(biāo)記的特征峰進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

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在灌注4小時(shí)后,嘌呤的同位素標(biāo)記比例達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),在胚胎中的同位素標(biāo)記程度高于胎盤(pán),3種嘌呤(IMP、GMP和AMP)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記比例及每個(gè)同位素標(biāo)記狀態(tài)由柱狀圖展示。同時(shí)發(fā)現(xiàn),R5P中同位素標(biāo)記的比例均低于3種嘌呤,且在嘌呤前體一碳單位氨基酸Ser和Gly中也發(fā)現(xiàn)明顯的同位素標(biāo)記情況,提示3種嘌呤在胚胎中的生物合成均采用從頭合成的方式。

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\  結(jié)論驗(yàn)證

為驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論,作者在接下來(lái)的研究中進(jìn)行了[13C]和[15N]的同時(shí)標(biāo)記,在給妊娠中期小鼠[13C]葡萄糖之外,添加注射[γ-15N]谷氨酰胺一小時(shí),不出所料,果然在3種嘌呤中發(fā)現(xiàn)了[15N]的同位素標(biāo)記,從而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)仳?yàn)證了胚胎中的嘌呤是從頭合成的方式。

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使用[13C]和[15N]雙穩(wěn)定同位素標(biāo)記進(jìn)行代謝流的研究,對(duì)于分析儀器的分辨率要求非常高,該研究使用Q Exactive HF-X高分辨質(zhì)譜,在方法設(shè)置中使用12萬(wàn)分辨率,得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)。

下圖為使用12萬(wàn)分辨率設(shè)置采集的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Compound Discoverer軟件分析后得到的AMP的[M+H]+特征峰及其質(zhì)譜峰,在質(zhì)譜圖中,單同位素峰M+0使用淡紫色標(biāo)注,M+1同位素峰用綠色標(biāo)注,放大M+1同位素峰可看到AMP的[13C]和[15N]同位素峰被準(zhǔn)確標(biāo)注,可見(jiàn)其同位素峰分布的準(zhǔn)確度非常高。

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