二極管陣列檢測(cè)器——從現(xiàn)象到本質(zhì)看木犀草素

沈國(guó)濱  施磊  金燕

01紫外檢測(cè)器的進(jìn)階版本——二極管陣列檢測(cè)器(Diode Array Detector, DAD)

紫外檢測(cè)器(Ultraviolet Detector, UV)是目前HPLC應(yīng)用廣泛的檢測(cè)器，其工作原理是朗伯-比爾定律。紫外檢測(cè)要求被檢測(cè)樣品組分具有紫外吸收，通常選擇在被分析物有最大吸收的波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，以獲得最大靈敏度和抗干擾能力。可惜這會(huì)導(dǎo)致其它組分在該通道下的吸收變?nèi)跎踔翢o(wú)紫外吸收。因此，單通道紫外檢測(cè)器在對(duì)目標(biāo)化合物，特別是未知化合物進(jìn)行純度及定量分析時(shí)，結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的偏差。

圖1 朗伯-比爾定律（A=lg(1/T)=Klc）

二極管陣列檢測(cè)器(Diode Array Detector, DAD)是一種新型的光吸收檢測(cè)器，它采用光電二極管陣列作為檢測(cè)元件，形成多通道并行工作，可對(duì)光柵分離的所有波長(zhǎng)的光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，從而迅速?zèng)Q定具有*性和靈敏度的波長(zhǎng)?？傻萌我獠ㄩL(zhǎng)的色譜圖及任意時(shí)間的光譜圖，具有色譜峰純度鑒定、光譜圖檢索等功能，為定性、定量分析提供更豐富的信息。

圖2 二極管陣列檢測(cè)器

02 DAD在天然產(chǎn)物構(gòu)型變化監(jiān)測(cè)時(shí)的妙用

*味（學(xué)名：Lamiophlomis rotata）是唇形科*味屬植物，有活血祛瘀，消腫止痛的功效，是青藏高原*的一種重要藥用植物。木犀草素是*味葉中的主要成分 (Luteolin, CAS No. 491-70-3 )，是一種天然弱酸性的黃酮類化合物。木犀草素具有抗炎、抗過(guò)敏等作用，可用于治療COPD、支氣管哮喘以及慢性咽炎、變應(yīng)性鼻炎等引起的慢性咳嗽。

圖3 木犀草素結(jié)構(gòu)式

本文基于賽默飛液相色譜系統(tǒng)和二極管陣列檢測(cè)器，開發(fā)了一種可用于檢測(cè)中藥*味膠囊提取液中木犀草素含量的方法。通過(guò)DAD檢測(cè)器不僅可以實(shí)現(xiàn)定量分析，也可以用于色譜峰的定性分析。同時(shí)利用DAD全波長(zhǎng)掃描的結(jié)果以證實(shí)木犀草素在流動(dòng)相pH變化時(shí)會(huì)發(fā)生最大吸收波長(zhǎng)紅移，從而影響其在C18色譜中的保留等現(xiàn)象進(jìn)行解釋。

03 實(shí)驗(yàn)部分

色譜條件

流動(dòng)相pH值對(duì)色譜行為的影響

圖4 流動(dòng)相不同pH對(duì)于保留時(shí)間和吸收波長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)表明木犀草素對(duì)于流動(dòng)相的pH敏感，依據(jù)計(jì)算模擬表明木犀草素的pKa 為 6.5±0.4。即在中性時(shí)，部分木犀草素可能以極性較強(qiáng)的離子形式存在，保留較弱；當(dāng)調(diào)節(jié)pH為酸性時(shí)，抑制了電離，使得該分子以分子形式存在。借助二極管陣列檢測(cè)器（DAD），可以實(shí)現(xiàn)全波長(zhǎng)掃描，可以獲得更全面的紫外光譜信息。木犀草素的紫外吸收波譜也對(duì)流動(dòng)相的pH敏感，不僅保留時(shí)間產(chǎn)生了較大的差異，且隨著堿性增強(qiáng)，最大吸收波長(zhǎng)產(chǎn)生紅移。表明該物質(zhì)會(huì)在不同pH條件下產(chǎn)生不同的構(gòu)象，且構(gòu)象的變化會(huì)引起共軛結(jié)構(gòu)的變化。

樣品分析結(jié)果

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品對(duì)照色譜圖（藍(lán)色：標(biāo)準(zhǔn)品，黑色：樣品）

圖6 樣品DAD三維色譜圖（插圖：8.640分鐘的紫外吸收光譜圖）

木犀草素保留良好，色譜峰形對(duì)稱，無(wú)雜質(zhì)干擾，可用于定性和定量分析。在0.3~100 μM 的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.9999。進(jìn)樣精密度良好，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的保留時(shí)間RSD均小于為0.2 %，峰面積RSD均小于為0.9 %。根據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的紫外吸收光譜，可見樣品中對(duì)應(yīng)色譜峰的最大吸收波長(zhǎng)與木犀草素一致，推斷該物質(zhì)為木犀草素。根據(jù)校正曲線計(jì)算可得*味膠囊提取液中木犀草素的摩爾濃度為27.4 μM。通過(guò)在樣品中加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)判斷方法的準(zhǔn)確性，該方法的回收率在95.9~103.0%之間。

04 結(jié)論

本文基于賽默飛液相系統(tǒng)和二極管陣列檢測(cè)器，開發(fā)了一種可用于檢測(cè)中藥*味膠囊提取液中木犀草素含量的方法。通過(guò)DAD檢測(cè)器不僅可以實(shí)現(xiàn)定量分析，也可以用于色譜峰的定性分析。利用DAD全波長(zhǎng)掃描結(jié)合其它有關(guān)計(jì)算，驗(yàn)證了木犀草素在不同pH條件下最大吸收波長(zhǎng)產(chǎn)生了紅移，從而影響其在C18色譜中的保留。本文報(bào)道的方法能為極性小分子檢測(cè)方法的開發(fā)提供定性和定量分析實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為闡明色譜柱中的保留機(jī)理提供了理論依據(jù)，凸出了全波長(zhǎng)掃描DAD檢測(cè)器在分析物質(zhì)變化過(guò)程和監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程時(shí)的優(yōu)勢(shì)。