AsPC-1/GEM人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細(xì)胞耐吉西他濱（STR鑒定）

細(xì)胞描述

一個(gè)胰腺癌病人的腹水中的細(xì)胞移植到裸鼠后建立了這個(gè)細(xì)胞株.

細(xì)胞特性

1） 來源：胰腺；轉(zhuǎn)移灶；腹水腺癌  

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x106 細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用

AsPC-1/GEM人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細(xì)胞耐吉西他濱（STR鑒定）

細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)建實(shí)驗(yàn)步驟

1. MTT法檢測ASPC-1對吉西他濱的IC50

將處于對數(shù)生長期的ASPC-1細(xì)胞傳代后，以6000/孔的密度接種在96孔板里，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，將培養(yǎng)基更換為含不同濃度吉西他濱的培養(yǎng)基，濃度依次為0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。置于含5%CO2、飽和濕度的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。取出96孔板，每孔加入20ul MTT（5 mg/mL）溶液加入到每個(gè)培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后，取出96孔板，吸除培養(yǎng)基，排槍每孔加入150 µL Formazan溶液，置搖床上低速振蕩10-30min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在OD 570nm處測量各孔的吸光值，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出IC50為0.8μg/mL，則選擇此濃度作為ASPC-1耐藥株誘導(dǎo)的起始濃度。

2. ASPC-1細(xì)胞耐藥分步誘導(dǎo)

取處于對數(shù)生長期的ASPC-1細(xì)胞，加入含0.8μg/mL吉西他濱的培養(yǎng)基，置于含5%CO2、飽和濕度的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日換液（同濃度含藥培養(yǎng)基），待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長后加大藥物濃度，每次增加2倍，直至10個(gè)月后，細(xì)胞可以在含18μg/mL吉西他濱的培養(yǎng)基保持穩(wěn)定生長4day，視為細(xì)胞耐藥成功，并命名為ASPC-1/GEM。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2）請?jiān)?/span>4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過程中會因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長密度達(dá)70%-80%以上，可以對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。

4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。                      

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備DMEM 培養(yǎng)基，優(yōu)質(zhì)胎牛血清15%，GlutaMAX-11%，P/S 1%（可在培養(yǎng)基中加入最大耐藥濃度18ug/ml的GEM)

2） 細(xì)胞在剛復(fù)蘇時(shí)較為脆弱，未貼壁期間和貼壁前期需用不含GEM的培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)再根據(jù)需要濃度添加 GEM。（不要直接加到最大耐藥濃度），傳代時(shí)中止液須為不含GEM的培養(yǎng)基。

3）若細(xì)胞生長狀態(tài)較為緩慢時(shí)，可適當(dāng)降低GEM的濃度，或使用不含GEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長狀態(tài)較好時(shí)，再更換為所需的GEM濃度。

4）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

5）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。 

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項(xiàng)：

1. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時(shí)，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險(xiǎn)力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚(yáng)的碎屑造成人員傷害。