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VF 647 Click-iT EdU 通用型細(xì)胞增殖檢測試劑盒

MCE 國際站：VF 647 Click-iT EdU Universal Cell Proliferation Detection Kit

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲條件： -20°C ， 3 年避光保存，避免反復(fù)凍融。

簡介：MCE VF 647 Click-iT EdU 通用款細(xì)胞增殖檢測試劑盒含有 EdU 及 VF 647 Azide 染料試劑，另配套含有點擊化學(xué)所需的催化劑、緩沖液，從而實現(xiàn)簡單、快速、高效、靈敏地細(xì)胞增殖檢測。

概述：細(xì)胞增殖能力的檢測對評估細(xì)胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等至關(guān)重要.。準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖檢測方法為直接檢測細(xì)胞中新 DNA 的合成，傳統(tǒng)的 BrdU （5-Bromo-2'-deoxyuridine） 法步驟繁多，且需要使用 BrdU 抗體，影響因素較多，穩(wěn)定性較差。EdU （5-Ethynyl-2'deoxyuridine） 法是一種在 BrdU 法基礎(chǔ)上升級換代的新方法，只需多聚甲醛固定和 Triton X-100 促滲就可以使檢測試劑進入細(xì)胞，少量的疊氮化染料通過點擊化學(xué)反應(yīng) (Click Chemistry) 即可快速有效地標(biāo)記出整合的 EdU。MedChemExpress VF 647 Click-iT EdU 通用款細(xì)胞增殖檢測試劑盒含有 EdU 及 VF 647 Azide 染料試劑，另配套含有點擊化學(xué)所需的催化劑、緩沖液，從而實現(xiàn)簡單、快速、高效、靈敏的細(xì)胞增殖檢測。除檢測細(xì)胞增殖外，試劑盒中額外提供的 Hoechst 33342 ，可用于細(xì)胞周期分析。本試劑盒適用于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀等檢測，對于 96 孔板檢測可檢測 100 孔樣

描述：

MCE VF 647 Click-iT EdU 通用細(xì)胞增殖檢測試劑盒含有 EdU 和 VF 647 疊氮化物染料，以及點擊化學(xué)所需的催化劑和緩沖液。它可用于簡單、快速、高效和靈敏的細(xì)胞增殖檢測。試劑盒中還提供 Hoechst 33342 用于細(xì)胞周期分析。該試劑盒適用于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測。100T 指檢測 96 孔板的 100 個樣本。

操作說明：細(xì)胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔 4 × 103 - 1 × 105 細(xì)胞（可根據(jù)細(xì)胞大小、生長速度以及實驗處理的具體要求調(diào)整細(xì)胞數(shù)量和密度）接種于 96 孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段藥物處理：根據(jù)實驗需要進行各種藥物處理或者其他刺激處理等EdU 標(biāo)記1) 用細(xì)胞培養(yǎng)基按一定比例稀釋 EdU 溶液至合適濃度后加入細(xì)胞中，混勻；設(shè)置不加 EdU 處理的陰性對照組。注：對于 A594、 HeLa 和 NIH/3T3 等貼壁細(xì)胞，推薦 EdU 的終濃度為 10 µM 。但細(xì)胞類型、培養(yǎng)液種類、細(xì)胞密度、細(xì)胞增殖速度等多方面因素會影響 EdU 摻入到細(xì)胞中的量，因此初次使用時建議設(shè)置 EdU 濃度梯度。如果之前使用過 BrdU 進行實驗，則可以參考 BrdU 濃度作為 EdU 的濃度。2) 細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 2 h ，去除培養(yǎng)基。注：最佳孵育時間的長短取決于細(xì)胞生長速率，通常宜孵育細(xì)胞周期 10% 左右的時間。對于常見的哺乳動物細(xì)胞如 HeLa、 3T3、 HEK293 等，細(xì)胞周期大約 18 - 25 h ，孵育時間一般在 2 h 左右。人胚胎細(xì)胞的細(xì)胞周期約 30 min ，推薦孵育 5 min ；酵母細(xì)胞的細(xì)胞周期約 3 h ，推薦孵育 20 min ；神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞周期約 5 d， 推薦孵育 24 h 。EdU 濃度與孵育時間相關(guān)，短時間孵育 (< 2 h) 宜采用高濃度，如: 10 - 50 μM ； 長時間孵育 (> 24 h ) 宜采用低濃度，如: 1 - 10 μM。細(xì)胞固定化注：對于需要做表面抗原標(biāo)記的實驗，可以考慮在完成 EdU 孵育后，以洗滌液洗滌細(xì)胞 2 次，在細(xì)胞固定化之前進行。1) 以 PBS 清洗細(xì)胞兩次，每次 3 - 5 min ，以除去未摻入 DNA 的 EdU 殘留，貼壁不牢的細(xì)胞可降低清洗強度。注：離心條件可參考特定細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗進行設(shè)置。2) 每孔加入 50 μL 細(xì)胞固定液，室溫固定 30 min ，去除固定液。注：低濃度的多聚甲醛固定液有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保持，但也可采用其他方式進行細(xì)胞固定；固定處理后細(xì)胞沉降系數(shù)發(fā)生變化，需根據(jù)細(xì)胞的情況調(diào)整離心力，可參考該細(xì)胞在其他實驗中通透后的離心條件。3) 每孔加入 50 μL 2 mg/mL 甘氨酸溶液，室溫孵育 5 min ，去除甘氨酸溶液。注：此步驟的目的是中和過量的醛基，保證染色反應(yīng)體系。當(dāng)采用非醛類固定劑進行細(xì)胞固定時可酌情省略此步驟。4) 每孔加入 100 μL 洗滌液洗滌細(xì)胞 2 次，每次 3 - 5 min ，去除洗滌液。5) 每孔加入 100 μL 滲透劑，室溫孵育 10 min ，去除滲透劑。注：必要時可延長通透時間增加細(xì)胞膜通透性EdU 檢測注：本參考步驟針對 96 孔板每孔 100 μL 的工作液來進行，用戶可以根據(jù)自己的樣本情況調(diào)整用量。1) 依據(jù)下表準(zhǔn)備 Click-iT 工作液。注：Click-iT 工作液須在配制后 15 min 內(nèi)使用。2) 每孔加入 100 μL 洗滌液洗滌細(xì)胞 2 次。3) 每孔加入 100 μL Click-iT 工作液，均勻覆蓋細(xì)胞，室溫避光孵育 30 min ，去除 Click-iT 工作液。4) 每孔加入 100 μL 洗滌液洗滌細(xì)胞 2 次，去除洗滌液，每孔加入 100 μL 保存液保持細(xì)胞濕潤。如其他無特別要求，即可進行拍照分析或流式細(xì)胞儀檢測。DNA 復(fù)染或細(xì)胞內(nèi)抗原標(biāo)記 ( 可選步驟 )DNA 復(fù)染1) 用 PBS 將 Hoechst 33342 稀釋 2000 倍，2 - 8°C 避光保存。2) 每孔加 100 μL Hoechst 33342 溶液 (1 ×) ，室溫避光孵育 30 min ，去除染色反應(yīng)液。3) 每孔用 100 μL PBS 洗滌細(xì)胞 1 - 3 次。細(xì)胞內(nèi)抗原標(biāo)記1) 加入抗體工作液，混勻。2) 避光條件下，以合適的溫度及時間孵育抗體。檢測及分析1) 建議染色完成后立即進行熒光顯微鏡拍照觀察或流式細(xì)胞儀檢測；如果條件限制，請避光 4°C 濕潤保存待測，但不應(yīng)超過 3 d 。若為細(xì)胞爬片或涂片，可使用抗熒光淬滅封片機封片后 4°C 條件下避光保存以提高保存效果。2) 進行熒光顯微鏡觀察增殖細(xì)胞的染色情況，可選擇進行 Hoechst 復(fù)染再檢測。Hoechst 33342 為藍色熒光，最大激發(fā)波長為 350 nm ，最大發(fā)射波長為461 nm 。 VF 647 Azide 為紅色熒光，最大激發(fā)波長為 650 nm ，最大發(fā)射波長為 670 nm 。3) 流式檢測的細(xì)胞數(shù)量建議盡量能達到百萬級，若細(xì)胞數(shù)量較少，檢測的細(xì)胞數(shù)量可調(diào)整為十萬級起始進行實驗。對于細(xì)胞得率過少（剛到萬級）的情況，可適當(dāng)減少步驟 5 (3) 中的清洗次數(shù)。4) 由于流式細(xì)胞儀檢測比較靈敏，可根據(jù)細(xì)胞類型和實際染色情況對 VF 647 Azide 的使用量進行適當(dāng)調(diào)整

注意事項：1. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進行后續(xù)實驗。2. 熒光染料均存在淬滅問題，實驗操作時請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。3. Click-iT Additive 配制成溶液后請注意適當(dāng)分裝， -20°C 保存。如溶解后有白色物質(zhì)析出，請上下顛倒數(shù)次，待其溶解后使用。 4. 本品會影響 GFP、 RFP、 mCherry 等熒光蛋白的熒光，對于熒光蛋白如 GFP、 TC-FLAsH 和 TC-ReAsH 類試劑，需要在 Click 反應(yīng)前進行反應(yīng)和檢測。由于 Phalloidin 不兼容 Click 反應(yīng)，推薦使用 Tubulin-Tracker Red (HY-131010) 進行細(xì)胞微管的檢測。5. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作

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