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鏈霉親和素瓊脂糖 6FF

MCE 國際站：Streptavidin Agarose 6FF

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件：2-8°C，禁止凍結(jié)，兩年

簡介：MCE Streptavidin Agarose 6FF 以高度交聯(lián)的 6% 瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法共價(jià)偶聯(lián)了重組鏈霉親和素，結(jié)合能力更強(qiáng)，每毫升介質(zhì)可結(jié)合 200 nmol Biotin。

概述：MCE Streptavidin Agarose 6FF 是用于分離純化生物素化蛋白、抗體、凝集素等的親和層析介質(zhì)。鏈霉親和素 (Streptavidin) 最早發(fā)現(xiàn)于阿維丁鏈霉菌(Streptomyces avidinii) 的培養(yǎng)液中，是一種四聚體蛋白質(zhì)。與親和素 (Avidin) 相比，鏈霉親和素同樣含有四個(gè)生物素 (D-Biotin) 結(jié)合位點(diǎn)，但其不含碳水化合物側(cè)鏈，具有近中性的等電點(diǎn) 6.5 (親和素為 10)，更有利于生物反應(yīng)進(jìn)行，因此鏈霉親和素特異性結(jié)合能力更強(qiáng)。由于鏈霉親和素與生物素的親和力特別強(qiáng)，純化時(shí)需要在變性條件下洗脫；而鏈霉親和素與亞氨基生物素的親和力相對(duì)較弱，可在 pH 9.5-11.0 結(jié)合，pH 4.0 洗脫，無需使用變性劑。MCE Streptavidin Agarose 6FF 以高度交聯(lián)的 6% 瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過化學(xué)方法共價(jià)偶聯(lián)了重組鏈霉親和素，結(jié)合能力更強(qiáng)。本產(chǎn)品中凝膠體積占懸液總體積的一半 (即每 1 mL 總體積中 0.5 mL 為凝膠)。使用時(shí)，需將 Streptavidin Agarose 6FF 充分重懸混勻后吸取

描述：

從鏈霉菌中分離的鏈霉親和素每摩爾蛋白質(zhì)可結(jié)合 4 摩爾生物素，親和力強(qiáng)。鏈霉親和素沒有碳水化合物基團(tuán)，等電點(diǎn)為 6.5（與親和素不同），非特異性結(jié)合較少。鏈霉親和素與生物素的親和力很強(qiáng)，純化時(shí)需要在變性條件下洗脫。然而，鏈霉親和素對(duì)亞氨基生物素的親和力相對(duì)較弱，在 pH 9.5-11.0 時(shí)結(jié)合，在 pH 4.0 時(shí)洗脫，無需使用變性劑。

操作說明：1. 推薦緩沖液 (自備)：注：建議用高純水配制 Buffer，且配制后通過 0.45 μm 濾膜過濾除菌。2．樣品準(zhǔn)備1）上柱前，建議將樣品離心或經(jīng)濾膜過濾 (0.22 μm 或 0.45 μm)，以減少雜質(zhì)，避免柱子堵塞。2）上柱前，建議使用平衡/洗雜緩沖液對(duì)樣品 (血清、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液等) 進(jìn)行稀釋或透析，以確保樣品溶液中含有合適的離子強(qiáng)度和 pH 值。3. Streptavidin Agarose 6FF 裝填使用時(shí)，需將 Streptavidin Agarose 6FF 充分重懸混勻后吸取。3.1重力柱的裝填使用重力柱前請(qǐng)先潤洗上、下墊片。1）選擇合適規(guī)格的重力層析柱，裝入下墊片，使用 ddH2O 潤洗柱管及墊片，關(guān)閉下出口。2）吸取適量 Streptavidin Agarose 6FF 混懸液至重力柱中，打開下出口，流干保護(hù)液。注：a) 注意觀察保護(hù)液流出速率以及時(shí)補(bǔ)充柱內(nèi) Streptavidin Agarose 6FF。b) 避免填料內(nèi)出現(xiàn)空隙。3）加入適量 ddH2O 沖洗凝膠，待柱內(nèi)液體流干后，關(guān)閉下出口。4）將潤洗好的上墊片裝入柱子。注：盡量避免墊片與填料之間出現(xiàn)空隙。5）裝填好的重力柱可直接加入平衡緩沖液進(jìn)行平衡。暫不使用時(shí)請(qǐng)及時(shí)加入保護(hù)液 (含 20% 乙醇的 1× PBS)，于 2-8°C 保存。3.2 中壓層析柱的裝填本產(chǎn)品也適用于各種中壓色譜層析柱。裝柱前，需根據(jù)層析柱半徑計(jì)算柱子的底面積，根據(jù)柱子所需裝填的高度計(jì)算所需凝膠的體積中壓層析柱的裝填方法參照如下：1）使用 ddH2O 沖洗層析柱篩板與接頭，確保柱底篩板上無氣泡后關(guān)閉柱底出口，并在柱底部留存 1-2 cm 的 ddH2O。2）將 Streptavidin Agarose 6FF 充分混合均勻，小心地將混懸液連續(xù)倒入層析柱中。注：借助玻璃棒沿柱壁倒入可減少氣泡的產(chǎn)生。3）若使用儲(chǔ)液器，需立即在層析柱和儲(chǔ)液器中加滿水，將進(jìn)樣分配器置于混懸液表面，連接至泵上。注：盡量避免分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。4）將層析柱連接至泵上，打開層析柱底部出口，開啟泵，使其在設(shè)定流速下進(jìn)行，流速大約為 0.5-1 mL/min，可適當(dāng)調(diào)整。先讓緩沖液緩慢流過層析柱，后緩慢增加至最終流速，以避免液壓對(duì)所形成柱床的沖擊，也可避免柱床的不均勻。當(dāng)柱床的高度穩(wěn)定后，在最后的裝柱流速下至少再上 3 倍柱床體積的 ddH2O。標(biāo)記柱床高度。注：a）若達(dá)不到推薦的壓力或流速，可使用泵的最大流速，以期得到很好的裝填效果。b）在色譜程序中，緩沖液流速不要超過最大裝柱流速的 75%。5）關(guān)閉泵，關(guān)閉層析柱出口。6）若使用儲(chǔ)液器，需去除儲(chǔ)液器，將分配器置于層析柱中。7）將分配器推至柱床的標(biāo)記高度。允許裝液進(jìn)入分配器，鎖緊分配器接頭。8）將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中，進(jìn)行柱平衡。注：可根據(jù)需求重新調(diào)整分配器。4. 樣品純化樣品純化可采用離心法、重力柱法或中壓層析柱法。4.1 離心法1）依照所需純化的樣品量，取適量 Streptavidin Agarose 6FF 混懸液加入離心管中，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清。2）加入 5 倍凝膠體積的平衡液清洗，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清，重復(fù) 2 次。3）加入樣品，封閉離心管，4°C 孵育 2-4 h (或 37°C 孵育 0.5-2 h)。4）孵育完成后，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清 (上清可保留作為流穿液，用于電泳鑒定)。5）使用 5 倍凝膠體積的洗雜液清洗，1,000 rpm 離心 1 min，棄上清，重復(fù) 3-5 次。注：棄上清時(shí)應(yīng)避免吸入介質(zhì)，清洗過程中建議更換新的 EP 管。6）使用 3-5 倍凝膠體積的洗脫液進(jìn)行洗脫，室溫孵育 5 min，1,000 rpm 離心 1 min，可重復(fù) 2-3 次。7）使用 5-10 倍凝膠體積的平衡液沖洗介質(zhì)，再用 5-10 倍凝膠體積的 ddH2O 沖洗，最后使用 2 倍凝膠體積的 20% 乙醇沖洗，并置于 2-8°C 保存。4.2 重力柱法1）柱平衡。使用 5 倍柱體積的平衡液對(duì)已裝填好的 Streptavidin Agarose 6FF 重力柱進(jìn)行柱平衡。重復(fù) 2-3 次。2）加樣。樣品加入后至少保留 2 min，以保證樣品與介質(zhì)充分接觸，收集流出液。注：反復(fù)上樣可增加結(jié)合效率。3）洗雜。使用 10-15 倍柱體積的洗雜液進(jìn)行洗雜，以去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。4）洗脫。使用 5-10 倍柱體積的洗脫液進(jìn)行洗脫，分段收集，將每一個(gè)柱體積收集為一管，分別檢測(cè)。既能保證目的蛋白能被洗脫掉，又能保證蛋白的濃度與純度。5）使用 5-10 倍柱體積的平衡液沖洗介質(zhì)，再用 5-10 倍柱體積的 ddH2O 沖洗，最后使用 2 倍柱體積的 20% 乙醇沖洗，并置于 2-8°C 保存。4.3 中壓層析柱法1）在泵管道中注滿 ddH2O，取掉上塞子，連接層析柱與色譜系統(tǒng)，打開下出口，將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中，旋緊。2）使用 3-5 倍柱體積的 ddH2O 沖洗。3）使用 ≥5 倍柱體積的平衡液平衡色譜柱。4）利用泵或樣品環(huán)上樣。注：a）上樣量避免超過柱子的結(jié)合能力。b）樣品粘度或體積增加可能會(huì)造成層析柱反壓。5）使用 ≥10-15 倍柱體積的洗雜液沖洗柱子，至紫外吸收達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的基線。6）使用 5-10 倍柱體積的洗脫液洗脫，收集的洗脫液即為目的蛋白。7）使用 5-10 倍柱體積的平衡液沖洗介質(zhì)，再用 5-10 倍柱體積的 ddH2O 沖洗，最后使用 2 倍柱體積的 20% 乙醇沖洗，并置于 2-8°C 保存。5. SDS-PAGE 檢測(cè)使用 SDS-PAGE 檢測(cè)純化效果 (原始樣品、流出組分、洗雜組分及洗脫組分)。注：鹽酸胍的帶電性較強(qiáng)，會(huì)中和 SDS 的電荷，故會(huì)影響蛋白在上樣緩沖液中的帶電性，電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生沉淀，因此可對(duì)樣本進(jìn)行透析或鹽析。透析時(shí)可利用透析袋，PBS 作為透析液，透析 2 次，1 h/次，建議透析液體積為樣本的 100 倍。為了減少 pH 快速變化引起的蛋白質(zhì)沉淀，可添加 1 M Tris (pH 9.0) 來中和組分。6. 填料清洗本產(chǎn)品可重復(fù)使用，無需再生。但隨著非特異性結(jié)合的蛋白增多及蛋白聚集，填料載量及流速會(huì)明顯下降，因此需對(duì)填料進(jìn)行清洗。

注意事項(xiàng)：1. 請(qǐng)勿干燥或冷凍本產(chǎn)品，以免引起效價(jià)降低，降低純化效率。2. 實(shí)驗(yàn)中，樣本需在 4°C 或置于冰上操作。3. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。4. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作

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