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Anti-Flag 親和凝膠

MCE 國際站：Anti-Flag Affinity Gel

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲(chǔ)條件： -20℃ 兩年

簡(jiǎn)介：MCE Anti-Flag Affinity Gel 用于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物以及體外表達(dá)系統(tǒng)中 Flag 標(biāo)簽蛋白的免疫沉淀、蛋白純化實(shí)驗(yàn)。

概述：MCE Anti-Flag 親和凝膠 (Anti-Flag Affinity Gel) 是由高質(zhì)量的鼠源 lgG2b 單克隆抗體與瓊脂糖 Sepharose 4B 共價(jià)偶聯(lián)而得，具有較高的 Flag (DYKDDDDK) 標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合容量 (>1.1 mg 蛋白/mL)，可用于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物以及體外表達(dá)系統(tǒng)中 Flag 標(biāo)簽蛋白的免疫沉淀 (IP) 實(shí)驗(yàn)。本產(chǎn)品蛋白荷載量高，特異性強(qiáng)，也可用于免疫共沉淀 (Co-IP) 及蛋白純化實(shí)驗(yàn)。本產(chǎn)品每 1 mL 總體積中 0.5 mL 為凝膠。使用前，需將凝膠充分重懸混勻后吸取。

描述：

MCE Anti-Flag 親和凝膠是一種純化的小鼠 IgG2b 單克隆抗體，共價(jià)連接到瓊脂糖 Sepharose 4B。該產(chǎn)品具有高蛋白結(jié)合能力（>1.1 mg 蛋白/mL）和穩(wěn)定性，非常適合在 E.coli、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的 Flag 標(biāo)記蛋白的高性能純化或免疫沉淀 (IP)。

特點(diǎn)：

1. 方便省時(shí)。

2. 非特異性結(jié)合率低。

3. 樣品損失最小。

4. 蛋白結(jié)合能力高達(dá) 1.1 mg/mL。

操作說明：1. 凝膠預(yù)處理1.1 將 Anti-Flag 親和凝膠重懸混勻，吸取 10 μL 凝膠懸液 (約 5 μL 凝膠) 至干凈的 1.5 mL 離心管。1.2 加入 600 μL 洗滌緩沖液，混合均勻，10,000 rpm 離心 30 秒，棄去上清。重復(fù) 3-4 次。注：小心吸取上清，避免凝膠損失。2. 樣品的結(jié)合2.1 在上述清洗干凈的凝膠中加入 500 μL 細(xì)胞裂解液。充分混勻后，置于翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育，4℃ 孵育 2 小時(shí) (如需提高結(jié)合效率，可延長至過夜)。2.2 10,000 rpm 離心 30 秒，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管 (上清液可用于檢測(cè) Flag 標(biāo)簽蛋白是否有殘留)。3. 洗滌在上述分離得到的凝膠中加入 500 μL 洗滌緩沖液，充分混懸凝膠，10,000 rpm 離心 30 秒，棄去上清。重復(fù)以上洗滌步驟 3 次以上，直到洗滌后的上清液中 OD280 小于 0.05 為止。注意：如上清液的 OD280 大于 0.05，適當(dāng)增加洗滌次數(shù)即可。4. 洗脫本說明書提供三種 Flag 標(biāo)簽蛋白洗脫方案，操作者可根據(jù)需要選擇不同的洗脫方案。4.1 變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測(cè)。步驟：在上述洗滌干凈的凝膠中加入 50 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，充分混勻后煮沸 5 分鐘。10,000 rpm 離心 30 秒，取 4 μL 上清液進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測(cè)。4.2 酸性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。步驟：在上述洗滌干凈的凝膠中加入 50 μL 洗脫緩沖液 A，充分混勻后室溫孵育 10 分鐘。10,000 rpm 離心 30 秒，收集上清。按照每 50 μL 洗脫液加入 25 μL 中和緩沖液的比例加入中和緩沖液，將洗脫產(chǎn)物 pH 調(diào)節(jié)至中性，樣品可用于后期功能分析。4.3 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：此方法洗脫的樣品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。步驟：在上述洗滌干凈的凝膠中加入 30-50 μL 洗脫緩沖液 B。充分混勻后，置于翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育，室溫孵育 1 小時(shí)或 4℃ 孵育 2 小時(shí)。10,000 rpm 離心 30 秒，收集上清，即得目的蛋白，樣品可用于后期功能分析

注意事項(xiàng)：1. 本產(chǎn)品使用前務(wù)必充分重懸凝膠。2. 使用本產(chǎn)品進(jìn)行 IP 實(shí)驗(yàn)前，需先確認(rèn)樣品中 Flag 標(biāo)簽蛋白的表達(dá)情況。3. 為最大限度的降低蛋白質(zhì)降解，請(qǐng)配合使用 MCE 蛋白酶抑制劑 cocktails (MCE 貨號(hào)：HY-K0010，HY-K0011)。4. 不要使用含有 dithiothreitol (DTT) 的細(xì)胞裂解液樣品，DTT 可能會(huì)引起凝膠上的 Flag 抗體脫落。5. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常見問題：1. 檢測(cè)結(jié)果條帶背景過高？A. 雜蛋白非特異性結(jié)合在抗體、凝膠或離心管壁上。建議對(duì)裂解液進(jìn)行預(yù)處理，去除非特異性蛋白；在最后一次洗滌前，將樣品轉(zhuǎn)移到新的離心管中操作。B. 洗滌效果不佳。建議增加洗滌時(shí)間及次數(shù)；增加 NaCl 或去垢劑的濃度。2. 檢測(cè)結(jié)果無條帶？A. Flag 標(biāo)簽蛋白沒有表達(dá)。建議操作：確保目的蛋白帶有 Flag 標(biāo)簽；制備新鮮裂解液；使用恰當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?(如 MCE 產(chǎn)品：HY-K0010，HY-K0011)。B. 孵育時(shí)間不足。建議延長孵育時(shí)間。C. 裂解液中存在高濃度的 DTT或其他的還原劑等干擾物質(zhì)。建議選用合適的裂解液。D. 過分洗滌。建議減少洗滌次數(shù)；降低 NaCl 或去垢劑的濃度

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