步驟1：擴增DNA段，作為焦磷酸測序模板的單鏈是生物素標記的。變性后，分離生物素標記的單鏈PCR擴增子，與測序引物雜交。雜交的引物和單鏈模板同各種酶一起將檢測和定量基因突變整合入一個強有力的體系，使用焦磷酸測序技術，相較于其他基于測序的方案在分析靶向短鏈DNA序列時，PyroMark平臺表現(xiàn)更卓yue。在表觀遺傳學研究中分析甲基化狀態(tài)，焦磷酸測序技術可高重復性的定量甲基化頻率，包括單個或連續(xù)的CpG位點，并可檢測和定量甲基化水平的微小變化。

對于遺傳檢測應用，焦磷酸測序技術可準確定量等位基因的可變位點，且很容易解決雜合性問題。 對于微生物鑒定和抗性分型，焦磷酸測序技術能夠同時分析多個樣本的常見的藥物抗性突變的。

原理

焦磷酸測序技術基于邊合成邊測序的原理，數(shù)分鐘內可獲得定量數(shù)據。PyroMark Q96 ID是提供實時序列信息的完整體系，高度適用于檢測遺傳變異、遺傳定量和短鏈DNA測序。以下的產品可配合PyroMark Q96 ID儀器使用：PyroMark Q96 Vacuum Workstation、PyroMark CpG SW、PyroMark Assay Design SW、PyroMark IdentiFire SW、PyroMark Gold Q96 Reagents和PyroMark Control Oligo。同時提供樣本制備方案，可使用PyroMark Q96 Vacuum Workstation制備單鏈DNA。

焦磷酸測序反應步驟：

孵育，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及底物腺苷酰硫酸（APS）和熒光素。

步驟2：脫氧核苷三磷酸（dNTP）加入反應中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP結合到DNA鏈上與其互補的堿基位。每次結合都會釋放與核苷酸相等摩爾量的焦磷酸（PPi）。

步驟3：在有APS的條件下，ATP硫酸化酶將PPi轉化為ATP。在這個ATP的驅動下，熒光素酶將熒光素轉化為氧化熒光素，并產生可見光，可見光的量與ATP的量成正比。通過電荷耦合（CCD）相機即可檢測到熒光素酶催化反應產生的可見光，并在原始數(shù)據輸出（Pyrogram）中顯示為一個峰，每個峰的高度（光信號）與結合的核苷酸數(shù)量成正比。

步驟4：三磷酸腺苷雙磷酸酶，是一種核苷酸降解酶，會降解未結合的核苷酸與ATP。*降解后，加入另一個核苷酸。

步驟5：持續(xù)添加dNTP。α-硫代脫氧腺苷三磷酸（dATPαS）在反應中用于替代天然脫氧腺苷三磷酸（dATP），這是因為DNA聚合酶可高效的應用前者，而不被熒光素酶識別。當該過程連續(xù)進行時，就會形成互補的DNA鏈，可根據Pyrogram追蹤的信號峰確定核苷酸序列。

簡化的工作流程—從樣本到結果

多功能PyroMark Q96 ID與表觀遺傳和遺傳分析流程無縫接合，且與QIAGEN良好的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉化和PCR擴增技術兼容。借助于高度可靠的儀器可在序列水平上對SNP、插入和缺失、CpG位點的檢測以及生成序列信息。簡化的工作流程可更快速地獲得結果。

快速方便的樣本制備

從PCR產物到直接用于測序的單鏈模板，應用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內同時制備96個樣本。該工作站操作簡單，且手工操作時間少于5分鐘。

流程

快速方便的樣本制備

從PCR產物到直接用于測序的單鏈模板，應用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內同時制備96個樣本。該工作站操作簡單，且手工操作時間少于5分鐘。

在焦磷酸測序之前，形成了一個生物素標記的PCR產物，該產物結合到覆蓋鏈酶親和素的瓊脂糖凝膠珠上。這些膠珠會被真空儀器捕捉并*清洗，隨后變性，得到適合于焦磷酸測序的單鏈DNA。該模板DNA放入含測序引物的焦磷酸測序反應板中，隨后引物退火，再將該板放入PyroMark儀器中即可。PyroMark Gold試劑包含用于焦磷酸測序反應的酶、核苷酸和底物，將這些試劑移入分配卡夾，按照軟件中提供的體積試被加入儀器中，用于焦磷酸測序。