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AUTOMACS系統(tǒng)自動(dòng)分選體系分選小鼠CD4+CD25+抑制性細(xì)胞
PriCells: AUTOMACS系統(tǒng)自動(dòng)分選體系分選小鼠CD4+ CD25+抑制性細(xì)胞
由此方法得到的陰性細(xì)胞（CD4+ CD25-）可用作反應(yīng)細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 小鼠
2. HBSS洗滌緩沖液
3. MACS緩沖液
4. CD8a（Ly-2）磁珠
5. 結(jié)合緩沖液
6. biotin-抗CD25（7D4）
7. Streptavidin-PE
8. 抗PE磁珠
9. *RPMI培養(yǎng)基
10. 小鼠CD3+T細(xì)胞富集柱和1×純化柱緩沖液
11. 15ml離心管，無(wú)菌
12. autoMACS系統(tǒng)和分選柱
13. 30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用20只小鼠的淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液并去除紅細(xì)胞。
2. 將細(xì)胞在20mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
3. 將細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。離心過(guò)程中，準(zhǔn)備3支小鼠CD3+T細(xì)胞純化柱，按說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)用1×純化柱緩沖液洗3遍。棄洗脫液，在每支純化柱下方放置一支15ml離心管。
4. 用3ml 1×純化柱緩沖液和3ml HBSS洗滌緩沖液混懸細(xì)胞。將細(xì)胞通過(guò)30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜后，每支純化柱中加入2ml細(xì)胞。室溫孵育15min。
5. 用2ml 1×純化柱緩沖液洗滌純化柱4或5遍以洗脫T細(xì)胞。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。
6. 將沉淀按每108個(gè)細(xì)胞加0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每108個(gè)細(xì)胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。
7. 4℃，200g離心10min。
8. 以MACS緩沖液混懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞通過(guò)30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜。將細(xì)胞放到autoMACS的上樣通道。選擇depletes程序（CD4+ T細(xì)胞將從陰性通道洗脫。
9. 回收細(xì)胞計(jì)數(shù)，在4℃，200g離心10min。
10. 用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。每108個(gè)細(xì)胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g離心10min。
11. 用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。每108個(gè)細(xì)胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。
12. 4℃，200g離心10min.
13. 用MACS緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。每108個(gè)細(xì)胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。
14. 4℃，200g離心10min。
15. 用MACS緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。將細(xì)胞放到autoMACS的上樣通道。選擇posseld程序（CD4+ CD25+細(xì)胞將從陽(yáng)性通道洗脫，CD4+ CD25-細(xì)胞將從陰性通道洗脫。