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磁珠分選柱手工操作分離小鼠CD4+CD25+抑制性細(xì)胞
PriCells: 磁珠分選柱手工操作分離小鼠CD4+ CD25+抑制性細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 小鼠
2. HBSS洗滌緩沖液
3. MACS緩沖液
4. CD8a（Ly-2）磁珠
5. 結(jié)合緩沖液
6. biotin-抗CD25（7D4）
7. Streptavidin-PE
8. 抗PE磁珠
9. *RPMI培養(yǎng)基
10. 小鼠CD3+T細(xì)胞富集柱和1×純化柱緩沖液
11. 15ml離心管，無菌
12. autoMACS系統(tǒng)和分選柱
13. 30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜
14. 不含氣體的MACS緩沖液，4℃（在上樣和洗柱過程中保持冰冷）
15. Midi MACS分離磁鐵
16. MACS多用支架
17. LD分選柱
18. 15ml離心管，無菌
19. LS分選柱
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用20只小鼠的淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液并去除紅細(xì)胞。
2. 將細(xì)胞在20mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
3. 將細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。離心過程中，準(zhǔn)備3支小鼠CD3+T細(xì)胞純化柱，按說明書的指導(dǎo)用1×純化柱緩沖液洗3遍。棄洗脫液，在每支純化柱下方放置一支15ml離心管。
4. 用3ml 1×純化柱緩沖液和3ml HBSS洗滌緩沖液混懸細(xì)胞。將細(xì)胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜后，每支純化柱中加入2ml細(xì)胞。室溫孵育15min。
5. 用2ml 1×純化柱緩沖液洗滌純化柱4或5遍以洗脫T細(xì)胞。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。
6. 將沉淀按每108個(gè)細(xì)胞加0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每108個(gè)細(xì)胞加入0.1ml CD8a（Ly-2）磁珠后4℃孵育15min。
7. 4℃，200g離心10min。
8. 按前述方法制備單細(xì)胞懸液，純化T細(xì)胞并加入CD8a（Ly-2）磁珠。
9. 將Midi MACS分離磁鐵安裝到MACS多用支架上，并將LD分選柱放到磁鐵中，每次用3ml 4℃不含氣體的MACS緩沖液沖洗分選柱共3次。棄洗脫液，在分選柱下方放置一支新的無菌15ml離心管。
10. 離心結(jié)束后棄上清，將沉淀用108個(gè)細(xì)胞/ml的MACS緩沖液*混懸。將細(xì)胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜。用0.1-0.4ml MACS緩沖液沖洗濾網(wǎng)。
11. 將細(xì)胞懸液上樣到LD分選柱上。
12. 用MACS緩沖液沖洗分離柱每次3ml，共3次。第一個(gè)3ml應(yīng)緩慢加入以免擾動(dòng)分選柱中的細(xì)胞。將洗脫液作為陰性細(xì)胞（CD4+ 細(xì)胞）保存。
13. 將細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。
14. 用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。每108個(gè)細(xì)胞加入15mg biotin-抗CD25（7D4）。4℃孵育15min。4℃，200g離心10min。
15. 用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。每108個(gè)細(xì)胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。
16. 4℃，200g離心10min.
17. 用MACS緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。每108個(gè)細(xì)胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。
18. 4℃，200g離心10min。
19. 按前述方案用結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞后加入biotin-抗CD25、Streptavidin-PE，以及抗PE磁珠。
20. 用MACS緩沖液混懸細(xì)胞使其濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。
21. 將一支LS分選柱放在Midi MACS分離磁鐵上，用MACS緩沖液每次3ml洗3遍LS柱。棄洗脫液，在分選柱下方放置一支新的15ml離心管。
22. 離心結(jié)束后棄上清，將沉淀用MACS緩沖液*混懸使細(xì)胞濃度達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。
23. 將細(xì)胞通過30mm尼龍網(wǎng)或40mm預(yù)分離濾膜。用0.1-0.4ml MACS緩沖液沖洗濾網(wǎng)。
24. 將細(xì)胞懸液加到LS柱上。
25. 用MACS緩沖液沖洗分離柱每次3ml，共3次。第一個(gè)3ml應(yīng)緩慢加入以免擾動(dòng)分選柱中的細(xì)胞。將洗脫液作為陰性細(xì)胞（CD4+ CD25-細(xì)胞）保存。
26. 將分選柱從磁鐵上取下。在分離柱中加入5ml MACS緩沖液。將活塞塞進(jìn)分離柱并洗脫陽性細(xì)胞（CD4+ CD25+細(xì)胞）。
27. 將細(xì)胞在4℃，200g離心10min。將CD25+細(xì)胞用1-2ml RPMI*培養(yǎng)基混懸。將CD25-細(xì)胞用10ml RPMI*培養(yǎng)基混懸。計(jì)數(shù)。