產(chǎn)品貨號(hào)：R21806

產(chǎn)品規(guī)格：50T

細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

尚寶生物 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶 染色 (PI staining)方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析的檢測(cè)試劑盒。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種可以嵌 合到雙鏈DNA和RNA的堿基對(duì)中并與之結(jié)合的熒光染料，無(wú)堿基特異性。碘化丙啶與雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生 熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì) 細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測(cè)定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的分析。碘化丙啶染色 后，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在 進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1～2之間。凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA的片段化 (DNAfragmentation)導(dǎo)致部分基因組DNA的片斷在染色過(guò)程中丟失，因此凋亡細(xì)胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染， 即熒光強(qiáng)度小于1，在流式檢測(cè)的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細(xì)胞峰。

細(xì)胞凋亡時(shí)，流式細(xì)胞檢測(cè)可呈現(xiàn)亞二倍體核型的特征，根據(jù)光散射的特點(diǎn)，PI染色可以區(qū)分細(xì)胞凋亡和細(xì) 胞壞死的細(xì)胞峰型。細(xì)胞凋亡時(shí)，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的前向光散 射低于正常。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞對(duì)前向角光散射的能力顯著降低，對(duì)側(cè)向光散射的能力增加或沒(méi)有變化。 在細(xì)胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號(hào)均降低。細(xì)胞壞死時(shí)細(xì)胞多表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，因此前向光散射高于 正常，對(duì)側(cè)向光散射高于正常。

尚寶生物 Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit經(jīng)常用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)， 亦可用于區(qū)分細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。該試劑盒檢測(cè)細(xì)胞含量范圍一般為0.1～1×10 6之間。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 胰蛋白酶消化液

2. 流式細(xì)胞儀

3. PBS

4. 預(yù)冷固定液：預(yù)冷的 70%乙醇或 4%多聚甲醛

操作步驟(僅供參考)：

1. 細(xì)胞樣品的制備：

⑴貼壁細(xì)胞：

① 小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)備用。

② 用胰蛋白酶消化細(xì)胞至可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的 名稱(chēng) 50T 保存條件 試劑(A): PI Stain Buffer 25ml -20℃ 試劑(B): PI Stain(20×) 1.5ml -20℃，避光 試劑(C): RNase A Solution(50×) 0.5ml -20℃ 貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。

③ 收集上述細(xì)胞懸液到離心管內(nèi)。

④ 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。

⑤ 加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)菌離心管。

⑥ 4℃，1000g 離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

⑦ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。

⑧ 輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

⑵懸浮細(xì)胞：

① 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

② 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。

③ 加入約1ml 提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)菌離心管。

④ 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

⑤ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

2. 細(xì)胞的固定：

加入1ml冰浴預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃條件下固定2h或更長(zhǎng)時(shí)間。4℃固定12～24h 可能效果更佳。

3. 細(xì)胞的清洗：

① 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

② 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl溶液，以免吸走細(xì)胞。

③ 加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)菌離心管。

④ 4℃，1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。

⑤ 小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。

⑥ 輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

4. PI 染色：

⑴ 一步法：

①PI 染色工作液的配制：根據(jù)待檢樣品的數(shù)量，取適量試劑(A)、試劑(B)、試劑(C)混合形成PI染色工作液。配 制好的PI染色工作液4℃避光保存待用，24h有效。

                                                                           1個(gè)樣品                     10個(gè)樣品

       試劑(A): PI Stain Buffer                                  500ul                       5ml

       試劑(B): PI Stain(20×)                                      25ul                       250ul

       試劑(C): RNase A Solution(50×)                      10ul                       100ul

       總量                                                                 535μl                     5.35ml

②在每個(gè)待檢細(xì)胞樣品中，加入500μl配制好的PI染色工作液，輕輕重懸細(xì)胞沉淀，置于37℃避光水浴 30min。

⑵ 兩步法：

①在沉淀細(xì)胞中加入40μl PBS和10μl RNase A Solution(50×)，置于37℃水浴30min。

②PI染色工作液的配制：根據(jù)待檢樣品的數(shù)量，取適量試劑(A)、試劑(B)混合形成PI染色工作液。配制好的 PI 染 色工作液4℃避光保存待用，24h有效。

                                                                               1個(gè)樣品                       10個(gè)樣品

                   試劑(A): PI Stain Buffer                           500ul                            5ml

                   試劑(B): PI Stain(20×)                             25ul                              250ul

                   總量                                                        525μl                            5.25ml

③在每個(gè)待檢細(xì)胞樣品中，加入500μl配制好的PI染色工作液，輕輕重懸細(xì)胞沉淀，置于4℃避光30min。

5. 檢測(cè)與分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用適當(dāng)分析軟 件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

染色結(jié)果：

凋亡細(xì)胞G1峰左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細(xì)胞群的峰型，在光散射譜上，前向光散射低于正常，側(cè)向光散射 高于正常。

注意事項(xiàng)：

1. 熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測(cè)。

2. 為減緩熒光淬滅可以使用抗熒光淬滅封片液。

3. 在為了獲得細(xì)胞沉淀的離心的過(guò)程中，對(duì)于特殊細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)提高離心力或延長(zhǎng)離 心時(shí)間。