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詳細(xì)介紹
Protein A Magnetic Beads 磁珠
Protein A磁珠在大小為0.2 um的納米磁珠上共價(jià)結(jié)合了大量的Protein A蛋白，與傳統(tǒng)的Protein A免疫沉淀瓊脂糖凝膠比較，抗體結(jié)合能力相同，背景更低的特點(diǎn)，由于采用磁性分離，使得每次IP和CoIP可以節(jié)省40%的時(shí)間。
名稱(chēng) | 特性 |
磁珠大小 | 0.2 μm |
磁珠濃度 | 10 mg/mL |
IgG 結(jié)合量 | 0.5 mg/mL |
適用范圍 | IP，CoIP等 |
穩(wěn)定性 | pH 6-8, 4oC長(zhǎng)期穩(wěn)定 |
儲(chǔ)存條件 | 4oC |
Protein A Magnetic Beads 磁珠儲(chǔ)存條件
pH 6-8, 4oC長(zhǎng)期穩(wěn)定，禁止產(chǎn)品凍結(jié)。
Protein A Magnetic Beads 磁珠使用說(shuō)明
1. 樣品制備
請(qǐng)根據(jù)不同的樣品選擇合適的處理方法：
樣品 | 樣品處理 |
血清 | 若目標(biāo)蛋白豐度較高，建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10~100 µg/mL，置于冰上備用（或置于-20℃長(zhǎng)期保存）。 |
懸浮細(xì)胞 | 離心收集細(xì)胞(4oC, 500 g, 10min)，棄上清后稱(chēng)重，按每毫克細(xì)胞50µL的比例用1× PBS洗滌 2次；按每毫克細(xì)胞5~10 µL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上處理10min；離心收集上清液(4oC, 12000g，10min)，置于冰上備用（或置于-20oC長(zhǎng)期保存）。 |
貼壁細(xì)胞 | 移去培養(yǎng)基，按每 1.0×105個(gè)細(xì)胞150 µL的比例用1×PBS洗滌兩次；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至1.5 mLEP管內(nèi)，按每 1.0×105個(gè)細(xì)胞20~30 µL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑，混勻后置于冰上處理10min，離心收集上清液(4oC, 12000g，10min)， 置于冰上備用（或置于-20oC長(zhǎng)期保存）。 |
大腸桿菌 | 離心收集大腸桿菌（4oC，12000g，2min），棄上清后稱(chēng)重，按每克（濕重）菌體10 mL的比例用1×PBS洗滌2次；按每克（濕重）菌體5~10 mL的比例加入結(jié)合緩沖液，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為1 mM的PMSF），重懸菌體，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清(4oC，12000g，10min)。 |
2. 磁珠預(yù)處理：
將磁珠充分混勻，取25~50 µL磁珠，400 µL結(jié)合緩沖液洗滌3次，棄上清。
3. 抗體與磁珠結(jié)合：
3.1 抗體稀釋?zhuān)?/span>結(jié)合緩沖液稀釋抗體至終濃度為5~50 µg/mL，置于冰上備用。
3.2 抗體結(jié)合：將準(zhǔn)備好的400 µL抗體加入準(zhǔn)備好的磁珠中，置于翻轉(zhuǎn)混合儀孵育（常溫30 min，4℃，2 h），后進(jìn)行磁性分離，收集上清液置于冰上以備后續(xù)檢測(cè)。
3.3洗滌（Washing）：400 µL結(jié)合緩沖液洗滌3次，每次10min。
*注意：結(jié)合過(guò)程中，磁珠可能會(huì)出現(xiàn)聚團(tuán)或呈片狀，屬于正?，F(xiàn)象 ，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4. 抗原與抗體-磁珠復(fù)合物結(jié)合
4.1 加入400 µL步驟1準(zhǔn)備的樣品，置于翻轉(zhuǎn)混合儀（常溫30 min，4℃，2 h）。
4.2 洗滌（Washing）：400 µL結(jié)合緩沖液洗滌4次，每次5min。
4.3 洗脫（Elution）：本操作說(shuō)明書(shū)提供以下兩種抗原洗脫方案，操作者可根據(jù)后期檢測(cè)的需要選擇不同的抗原洗脫方法。
4.3.1 變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測(cè)。分離磁珠，棄上清，向磁珠中加入60 µL 1× SDS-PAGE Loading Buffer混合均勻，100℃加熱10min。分離磁珠，收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。
4.3.1非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。分離磁珠，棄上清，向磁珠中加入25-50 µL洗脫緩沖液，室溫孵育10 min；分離磁珠，收集上清液至新的EP管，并立即加入1 µL中和緩沖液將洗脫產(chǎn)物pH調(diào)節(jié)至中性，用于后期功能分析。
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