冷凍干燥機(jī)如何對菌種進(jìn)行保藏

江蘇恒敏儀器冷凍干燥機(jī)主要部件分為干燥箱、凝結(jié)器、冷凍機(jī)組、真空泵、加熱/冷卻裝置等。凍干機(jī)起源于19世紀(jì)20年代的真空冷凍干燥技術(shù)，后真空凍干技術(shù)除了在醫(yī)藥上有著廣泛應(yīng)用，在生物制品、食品、血液制品、活性物質(zhì)領(lǐng)域之外的領(lǐng)域也發(fā)揮了重要作用。下面小編為大家介紹下微生物菌種的冷凍干燥保藏操作流程：
 凍干機(jī)適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的真空冷凍干燥保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。其操作流程如下：
 1、安瓿管準(zhǔn)備
 安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號及時間，加入脫脂棉塞后，121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。
 2、保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備
 保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100℃間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。
 3、凍干樣品的準(zhǔn)備
 在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯(lián)合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程》(試行))，與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短，在1-2小時內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時應(yīng)注意在無菌條件下操作。
 4、預(yù)凍
 一般預(yù)凍2小時以上，溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。
 5、冷凍干燥
 采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時間一般為8-20小時。
 終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：
 安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀；
 真空度接近空載時的zui高值；
 樣品溫度與管外溫度接近；
 選用1-2支對照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié)；
 選用一個安瓿管，裝1-2%氯化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié)；
 冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。
 6、真空封口及真空檢驗(yàn)
 將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。
 7、保藏
 安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。
 8、質(zhì)量檢查
 冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。新版GMP附錄1第三章第十一條規(guī)定應(yīng)當(dāng)對各個潔凈級別的微生物進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，以評估無菌生產(chǎn)的微生物狀況。其中監(jiān)測方法包含沉降菌法、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法等。與此同時，新版GMP更強(qiáng)調(diào)在關(guān)鍵操作的全過程均應(yīng)該對*潔凈區(qū)進(jìn)行懸浮粒子和微生物監(jiān)測。使灌裝與凍干區(qū)域相連接的半自動進(jìn)出料裝載機(jī)構(gòu)以L型布局形式出現(xiàn)，與以往的老式凍干機(jī)的大開門式相比較，因良好的隔離操作，環(huán)境控制更趨向于理性的數(shù)據(jù)控制，且無菌控制的可信度大大增加，L型布局的合理設(shè)計(jì)使*區(qū)域更集中，在環(huán)境監(jiān)測時，監(jiān)測點(diǎn)也更容易把握，便于實(shí)施。