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02/下篇
Knock-in
對(duì)于Knock-in，目前還存在一定的難度，大多數(shù)的出版物只能實(shí)現(xiàn)10-40%的敲入效率，不同位點(diǎn)也存在差異。Nature Biotechnology今年5月的一篇出版物利用SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in)技術(shù)可以在T細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)超過(guò)90%的KI效率，同樣在其他常用的免疫細(xì)胞如NK，B cell，IPSC等細(xì)胞都實(shí)現(xiàn)了非常高的KI效率。
對(duì)于常規(guī)的KI實(shí)驗(yàn)，我們依然可以從以下方面考量進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化：
Donor DNA用量的測(cè)試
▲ Theodore L Roth et al., 2018
▲ Zelda Odé et al., 2020
HA長(zhǎng)度
HA的長(zhǎng)度會(huì)影響KI的效率，但并不意味著越長(zhǎng)越好。
▲ Zelda Odé et al., 2020
▲ Soyoung A. Oh et al., 2022
HA修飾
▲ Brian R. Shy et al., 2021
▲ Jonas Kath et al., 2022
特殊成分提高HDR效率的測(cè)試
也有文獻(xiàn)結(jié)果表明PGA對(duì)KI的效率沒有幫助，僅供參考。
▲ Ya-Wen Fu et al., 2021
▲ David N. Nguyen et al., 2020
選擇dsDNA或ssDNA或AAV載體進(jìn)行KI
dsDNA會(huì)隨著用量的增加顯著增加對(duì)細(xì)胞活率的影響。
▲ Theodore L Roth et al., 2018
HDR Enhancer
▲ Jonas Kath et al., 2022
甚至HDR, RNP, 細(xì)胞的混勻順序也可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響
▲ Theodore L Roth et al., 2018
電轉(zhuǎn)前后培養(yǎng)體系
▲ Theodore L Roth et al., 2018
Nucleofection 條件優(yōu)化
通?？梢詤⒖糑O的條件進(jìn)行KI實(shí)驗(yàn)，但依然可以依照具體的實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整。
▲ Theodore L Roth et al., 2018
▲ Soyoung A. Oh et al., 2022
對(duì)于Knock-in，還可以通過(guò)其他手段提升結(jié)果，如PAM and Track mutations, 具體內(nèi)容可以參考如Cas蛋白或sgRNA供應(yīng)商。
通常KO不會(huì)對(duì)細(xì)胞的活率產(chǎn)生太大影響，但是對(duì)于KI，需要用到donor DNA，如dsDNA，或者使用更強(qiáng)的電轉(zhuǎn)染條件，這些可能會(huì)導(dǎo)致活率的負(fù)面影響。
