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在藥物研發(fā)過(guò)程中常用細(xì)胞學(xué)分析，來(lái)揭示化合物在體外誘導(dǎo)的效應(yīng)。本文中，我們將介紹使用VICTOR Nivo進(jìn)行細(xì)胞水平的HTRF檢測(cè)，分析α-微管蛋白乙酰化-K40水平。在人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，常發(fā)生微管蛋白乙酰化，因而被廣泛研究。αβ-微管蛋白異二聚體形成微管，微管是細(xì)胞骨架中的基本聚合物。通過(guò)翻譯后修飾（PTMs），細(xì)胞調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)和功能。α-微管蛋白在K40上的乙?；谄渌鸓TMs中起關(guān)鍵作用。

已知抑制HDAC6（組蛋白去乙?；?）后，會(huì)使微管蛋白乙?；险{(diào)，我們采用了小鼠成纖維細(xì)胞（NIH-3T3細(xì)胞），在VICTOR Nivo上進(jìn)行了兩個(gè)HTRF實(shí)驗(yàn)：首先，評(píng)估了分析所用的最佳細(xì)胞接種數(shù)量；其次，研究了化合物 Trichostatin A和Tubacin對(duì)α-微管蛋白K40乙?；挠绊?。

實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

1細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)化

將預(yù)先收獲的NIH-3T3細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基稀釋成50,000至3,125個(gè)細(xì)胞/孔密度，100μl/孔轉(zhuǎn)移至96-孔 CulturPlate (#6005680)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。隨后，依照操作手冊(cè)，用HTRF試劑盒中自帶的細(xì)胞裂解液裂解30分鐘，取16μl/孔細(xì)胞裂解上清液，轉(zhuǎn)移至384-孔 OptiPlate(#6007290)。然后分別加入Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate和Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-d2抗體各2μl，室溫孵育2小時(shí)。并設(shè)定三組對(duì)照作為質(zhì)控：

陽(yáng)性對(duì)照：

control lysate + Anti-alpha-Tubulin acetyl-K40-d2 + Anti alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

陰性對(duì)照：

lysis buffer + Anti-alpha-Tubulin acetyl- K40-d2 + Anti alpha-Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

空白對(duì)照：

cell lysate + detection buffer + Anti alpha- Tubulin acetyl-K40-Tb3+ Cryptate

孵育結(jié)束后，在VICTOR Nivo上檢測(cè)HTRF信號(hào)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照（control lysate）與陰性對(duì)照窗口大于2，符合實(shí)驗(yàn)指南；與陰性對(duì)照比值大于4。測(cè)試了５個(gè)NIH-3T3細(xì)胞接種密度，HTRF比值呈現(xiàn)密度依賴(lài)關(guān)系，選擇接種密度12,500個(gè)細(xì)胞/孔用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2化合物檢測(cè)

據(jù)報(bào)道，化合物Trichostatin A和Tubacin抑制HDAC6，從而增加細(xì)胞微管蛋白乙?；?。在96孔板中，接種NIH-3T3細(xì)胞12,500個(gè)/孔，培養(yǎng)1天后，加入待測(cè)化合物50 μl/孔。用另一96孔板制備化合物，以培養(yǎng)基稀釋12個(gè)化合物濃度（DMSO終濃度為0.5%）。Trichostatin A檢測(cè)濃度范圍為1.4x10-11–2.5x10-6M，Tubacin濃度范圍為1.4x10-9–2.5x10-4M。同時(shí)設(shè)置DMSO對(duì)照和未處理細(xì)胞對(duì)照。給藥18小時(shí)后，同上述方法檢測(cè)。兩種化合物均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，EC50 (Trichostatin A)=40.5±0.2nM 及EC50 (Tubacin)=4.95±0.84uM，與文獻(xiàn)報(bào)道所述數(shù)量級(jí)相符。

總結(jié)

VICTOR Nivo是一款體積小、功能強(qiáng)大的桌面多功能酶標(biāo)儀，配備了所有主要檢測(cè)技術(shù)：光吸收、化學(xué)發(fā)光、熒光強(qiáng)度、熒光偏振、AlphaScreen和時(shí)間分辨熒光（包括HTRF、LANCE和DELFIA）。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)基于細(xì)胞的α-微管蛋白乙酰-K40 HTRF分析試劑盒易于操作，非常適合在VICTOR Nivo上進(jìn)行HTRF模式檢測(cè)。在一系列實(shí)驗(yàn)中，VICTOR Nivo操作簡(jiǎn)單智能，用戶(hù)可按照protocol推薦的檢測(cè)參數(shù)，無(wú)需進(jìn)一步調(diào)整，即可讀板?？傊?，HTRF認(rèn)證的VICTOR Nivo適用并支持HTRF試劑盒檢測(cè)應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

Using the VICTOR Nivo for Cell-Based HTRF Assays | PerkinElmer