您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
會(huì)員.png)
7
重組人蛋白細(xì)胞因子的研究選擇-細(xì)胞因子
1．重組蛋白表達(dá)體系
MCE 重組蛋白表達(dá)體系主要有：大腸桿菌，酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物
細(xì)胞。
2．重組蛋白純度和濃度測(cè)定
重組蛋白純度測(cè)定方法：a. SDS-PAGE 測(cè)定法；b. HPLC 測(cè)定法；c. 銀染測(cè)
定法。
重組蛋白濃度測(cè)定方法：a. Bradford 蛋白定量測(cè)定法；b. BCA 蛋白定量測(cè)
定法；c. SDS-PAGE 蛋白定量測(cè)定法。
3．重組蛋白表達(dá)體系對(duì)比
| 表達(dá)體系 | 優(yōu)缺點(diǎn) |
| 原核體系 | 繁殖快、成本低，產(chǎn)量高，但不能進(jìn)行糖基化修飾，常為包涵體 |
| 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 結(jié)構(gòu)與天然蛋白接近，完善的翻譯后加工，活性更好，但表達(dá)水平較低，周期長(zhǎng)，技術(shù)要求高 |
| 酵母細(xì)胞 | 易操作，蛋白背景弱，適合大規(guī)模生產(chǎn)，便于純化，但存在產(chǎn)量不高以及糖基化達(dá)不到要求等問題 |
| 昆蟲細(xì)胞 | 功能與天然蛋白相似，對(duì)于部分有毒性或較難表達(dá)蛋白有優(yōu)勢(shì)，但糖基化程度低，形式比較單一，活性不如哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) |
4．重組蛋白表達(dá)體系選擇
| 研究目的 | 蛋白要求 | 適表達(dá)系統(tǒng) |
| 用作抗原，獲得特異性抗體 | 純度>80%，不需要蛋白修飾或天然活性，可帶標(biāo)簽 | 原核表達(dá)體系 |
| 用于檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)晶及晶體結(jié)構(gòu)研究 | 純度>95%，濃度通常在 10 mg/mL | 2/3 是原核表達(dá)體系，1/3 是昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系 |
| 蛋白的功能研究 | 需要保存蛋白的天然活性 | 原核表達(dá)體系和真核表達(dá)體系 |
| 用于藥物研究的蛋白質(zhì) | 一般要求盡量保存天然序列，具有天然活性 | 真核表達(dá)體系 |
5．重組蛋白開蓋使用前處理
為防止凍干粉產(chǎn)品的粉末沾在管壁或管蓋上，使用前請(qǐng)勿開蓋，離心(約
13000 rpm)處理 20-30 秒，使附于管蓋或管壁的蛋白收集于管底。MCE 保
證每管產(chǎn)品的蛋白總量達(dá)到標(biāo)示含量。
6．重組蛋白復(fù)溶
a. 使用前先離心(約 13000 rpm)處理 20-30 秒，使附于管蓋或管壁的蛋白
收集于管底。
b. 嚴(yán)格依據(jù)說明書，使用推薦的溶液將蛋白凍干粉溶解至推薦的濃度。大
多數(shù)重組蛋白建議溶解在滅菌超純水中，濃度不低于 100 μg/mL，以便于
后續(xù)進(jìn)一步稀釋至工作濃度。
c. 用移液槍輕吹混勻，或?qū)⒐苌w蓋好后輕柔顛倒數(shù)次進(jìn)行混勻，低速離心
數(shù)秒。
d. 復(fù)溶后的重組蛋白在室溫放置數(shù)分鐘，以保證蛋白能夠充分溶解。
7.重組蛋白儲(chǔ)存
由于每次凍融都會(huì)造成蛋白的部分變性，因此建議客戶收到產(chǎn)品后適量分
裝避免反復(fù)凍融。
a. 短期儲(chǔ)存：
凍干粉狀態(tài)產(chǎn)品在室溫下存放 3 周，不影響活性。
復(fù)溶后的產(chǎn)品在 4℃ 可穩(wěn)定儲(chǔ)存 1-2 周。
b. 長(zhǎng)期儲(chǔ)存：
凍干粉狀態(tài)產(chǎn)品在 -20℃ 下，可穩(wěn)定保存至少一年；推薦 -80℃ 長(zhǎng)期保存，
以獲得更穩(wěn)定性能的產(chǎn)品。
可選擇包含一定濃度載體蛋白(0.1% BSA， 5% HSA， 10% FBS，或 5% 海
藻糖)的溶液或培養(yǎng)基復(fù)溶產(chǎn)品，分裝后凍存于 -20℃ 下，可保存至少三個(gè)
月；推薦 -80℃ 長(zhǎng)期保存，以獲得更穩(wěn)定性能的產(chǎn)品。
注：分裝凍存時(shí)，蛋白濃度不低于 100 ng/μL，且每管的體積不可小于 20
μL。
8.重組蛋白標(biāo)簽影響
蛋白標(biāo)簽指重組蛋白制備過程中與目的蛋白融合表達(dá)的蛋白或多肽。MCE
的重組蛋白產(chǎn)品大部分為無標(biāo)簽狀態(tài)，但少數(shù)重組蛋白產(chǎn)品因?yàn)椴煌康?/span>
需要加有標(biāo)簽。
a. 標(biāo)簽利于蛋白純化。
b. 當(dāng)目的蛋白無特定抗體直接鑒定，可利用標(biāo)簽進(jìn)行 Western Blot 或
ELISA 分析方法鑒定。
c. Fc 標(biāo)簽可以提升重組蛋白的半衰期以提高分子的穩(wěn)定性，同時(shí)也能夠促
進(jìn)重組蛋白形成活性二聚體。
重組蛋白標(biāo)簽對(duì)蛋白的生物學(xué)活性影響存在未知結(jié)論，但對(duì)大部分檢測(cè)應(yīng)
用中，重組蛋白的標(biāo)簽對(duì)蛋白本身生物學(xué)活性并無影響，所以無需移除。
MCE 對(duì)重組蛋白產(chǎn)品都已經(jīng)做過生物學(xué)活性檢測(cè)并將數(shù)據(jù)公示于 COA 中。
9. 重組蛋白活力值與計(jì)算方法
MCE 重組蛋白的生物學(xué)活性 (ED50) 測(cè)定數(shù)據(jù)在 COA 中可以獲得。ED50 是
Effective Dose 50 的縮寫，是可誘導(dǎo) 50% 大反應(yīng)的蛋白濃度 (ng/mL)。
計(jì)算公式如下:
MCE 的重組蛋白產(chǎn)品并未采用 WHO (National Institute for Biological
Standards and Control) 設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定活力值，以上計(jì)算公式并不適
用于“International Units”和“ED50”的轉(zhuǎn)換關(guān)系，需要采用標(biāo)準(zhǔn)品
對(duì)比相同實(shí)驗(yàn)獲得該重組蛋白的 IU 值。
10. 重組蛋白 ED50 值的批間差
不同批次的產(chǎn)品或不同實(shí)驗(yàn)方法的測(cè)定都會(huì)導(dǎo)致重組蛋白產(chǎn)品的 ED50 值變
化，我們推薦客戶根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)測(cè)定得到合適的實(shí)際 ED50 值。
11. 重組蛋白應(yīng)用方案
MCE 重組蛋白產(chǎn)品的 COA 中顯示的實(shí)驗(yàn)方案只是確認(rèn)該產(chǎn)品的 ED50 值，
但并不與終端客戶的不同類型實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在等效性。如果客戶需要應(yīng)用在
不同于本公司產(chǎn)品測(cè)試的實(shí)驗(yàn)方法時(shí)，我們建議客戶通過實(shí)際測(cè)試獲得
佳 ED50 值。
12.重組蛋白的種屬交叉活性
重組蛋白的種屬交叉活性需要根據(jù)具體產(chǎn)品而定；建議盡量選擇對(duì)應(yīng)種屬
的重組蛋白。如實(shí)在無法匹配種屬，以下信息供參考：
a. 大多數(shù)人細(xì)胞因子對(duì)小鼠細(xì)胞有效 (僅少數(shù)例外)。
b. 多數(shù)小鼠細(xì)胞因子對(duì)人細(xì)胞有效，但特異性可能不強(qiáng)。如小鼠的表皮生
長(zhǎng)因子(EGF)對(duì)人的表皮細(xì)胞有活性，對(duì)人的其他種類細(xì)胞可能也有作用。
c. 干擾素、GM-CSF、IL-3、IL-4 具有種屬特異性，即重組人的這些細(xì)胞因
子只能作用于人細(xì)胞，對(duì)小鼠和大鼠等其他種而重組小鼠的這些細(xì)胞因子
也僅用于小鼠，對(duì)人的細(xì)胞無效。
d. 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGFs)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素 ( Neurotrophins，如 BDNGF、
GDNF、CNTF、β-NGF 等)、TGF-β 等高度保守，各種屬間交叉活性強(qiáng)。