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流式細胞術(shù)常見技術(shù)問題解答
⒈用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式細胞術(shù)？
看你說明書上是怎么說的了，如果沒有說就不可以做流式，需要另外買了。
⒉請問流式細胞術(shù)單抗直接熒光需要幾種對照？
首先確認你用的直標抗體的熒光染料是什么，再確定該抗體的來源種屬，選擇相應(yīng)的同型對照。如：你現(xiàn)在想檢測小鼠淋巴細胞表面的CD4抗原， 熒光染料為FITC， 抗體來源為大鼠的IgG1亞型， 即Rat anti Mouse CD4-FITC （IgG1）， 你所需要的同型對照就應(yīng)該是Rat IgG1-FITC， 一般的抗體說明上都會寫清。
⒊6孔板的細胞量能否做流式呀？
對于6孔板而言，每孔的表面積為10 cm2，依細胞種類不同在長滿時達到的數(shù)量從5*10的5次方到5*10的6次方不等。6孔板沒問題的！甚至24孔板也可以正常做。不過用于調(diào)試儀器參數(shù)的正常細胞要多準備一些。
⒋流式中檢測細胞表面和細胞內(nèi)蛋白表達水平的抗體有何區(qū)別？
抗體只是針對相應(yīng)抗原的，至于是針對胞內(nèi)還是胞膜對你檢測來說并無明顯影響，你只需要查清楚到底是針對哪一個部位的抗原的，應(yīng)該是可以用同一種抗體進行檢測的，在流式操作時只需注意：如果是針對胞內(nèi)，則需要加破膜劑，讓抗體能和相應(yīng)抗原接觸，否則就不需要了。
⒌只要是熒光抗體就可以用于共聚焦顯微鏡嗎？
一般情況下都是可以的。但有時候強度不夠，需要選擇熒光強度大的染料。
⒍流式細胞儀檢測細胞周期是否需要雞紅細胞作參照？
不用，標準微球做完laser alignment（光路校正）就可以了。盡量把微球的各色CV值控制在1.5以內(nèi)。
⒎流式細胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的？
FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度， FL2-H是指脈沖高度。通常在做細胞周期分析時應(yīng)用，用于去除粘連細胞。
⒏細胞膜蛋白變化是用流氏檢測好，還是要做western?
膜蛋白的提取，好像很費功夫，提取的不好，western結(jié)果也就不可信。流式需要的抗體很少，流式能夠檢測陽性表達細胞的比例，western能對總的表達定量，各有有缺點。
⒐培養(yǎng)細胞的bcl-2及Bax蛋白的檢測？
首先制成單細胞懸液，PBS洗滌后用胞內(nèi)染色試劑盒（很多公司都有，其實就是固定劑加增透/打孔劑）進行處理，再進行抗體孵育標記染色，洗滌后上樣。
⒑如何分選原始紅細胞？
CD71（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體）--幼稚細胞的標記
CD235（GPA）--紅細胞的標記（小鼠有Ter119）
雙陽性細胞即為幼稚紅細胞，但無法區(qū)分原始及中晚幼紅.
⒒怎樣選擇流式同型對照？
同型對照（Isotype Control）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（與一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.這個可以咨詢試劑商。同型對照為免疫熒光標記中的陰性對照。由于熒光標記單抗的組來源不同，應(yīng)選用相同來源的未標記單抗作為同型對照來調(diào)整背景染色。舉個例子：比如檢測一抗為單抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified（純化的） mouse IgG2a來做OX-42的同型對照（Isotype Control）。一般的的生物技術(shù)公司和國內(nèi)的代理都有出售。
同型對照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照也應(yīng)標記熒光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細胞的自發(fā)熒光、FC受體介導的抗體結(jié)合和非特異性抗體結(jié)合等影響因素。此外，同型對照與MoAb所標記的熒光色素、濃度、F：P比值（標記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應(yīng)該相同，這對準確設(shè)定陰性與陽性細胞的界標有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對照，為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產(chǎn)品。
⒓流式細胞技術(shù)測定細胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣。
在文獻及其他專業(yè)網(wǎng)站中都有測定游離鈣的方法，具體如下：
（1） 鈣熒光探針負載；
（2）隨機測定每管細胞懸液樣品（以下簡稱樣品）的單個細胞的熒光強度，記為F值。
（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化鈣，（問題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測定熒光即Fmax值。
（4）加入EGTA，20μl（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發(fā)波長488nm測定熒光，即Fmin值。這個過程中的氯化鈣的作用如何， 請高人指點， 謝謝。
因為正常血漿中Ca2＋濃度是1mM，細胞外液的Ca2＋對細胞內(nèi)Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細胞外Ca2＋進入細胞內(nèi)，作為大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為小值.生理環(huán)境中細胞內(nèi)鈣離子濃度遠低于細胞外液（大約1：10000），細胞膜對鈣的通透性變化對細胞內(nèi)鈣影響很大。
⒔流式與werstern的區(qū)別有哪些？
（1）Western 是檢測蛋白表達的金標準，可用于檢測細胞多種類型的蛋白；流式細胞術(shù)的方法多用于檢測細胞膜蛋白，雖然也可通過Triton-X100給細胞打孔的方法來檢測胞內(nèi)蛋白，但對于分泌蛋白卻是無能為力的；
（2）Western測蛋白含量對抗體的量需要很少，一般1：1000左右，而流式對抗體的需要量很大，一般1：50（很浪費抗體）；
（3）采用Western方法檢測細胞蛋白含量的變化一般要有內(nèi)參，而流式一般要把每個樣品分為兩份，同時都做只加二抗（FITC標記的）的對照，這樣平均到每個細胞的發(fā)光就不用內(nèi)參了；
（4）就個人經(jīng)驗而言，流式用多抗不好，單抗標出來不錯。
不過流式的應(yīng)用原理主要還是抗原和抗體反應(yīng)和western、免疫組化沒有本質(zhì)差別，但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系，因此，流式不適合檢測低表達的蛋白，低表達的還是采用western（尤其是化學發(fā)光底物更佳）和免疫組化更好。當然，流式大的一個特點就是，可以定量（百分比），如果是高表達的用流式細胞儀非常有優(yōu)勢。
⒕FL1， FL2， FL3 的區(qū)別是什么? 是指在不同位置測得的熒光?還是不同波長的熒光?這3個參數(shù)到底測的是什么?有什么意義?
你的理解是正確的，其實FL1， FL2， FL3 是指不同的熒光通道.舉個例子來說吧.我們用FITC/PE雙標記的細胞，在488nm的激光激發(fā)下，這兩種熒光染料分別發(fā)出波長不同的綠色和橙色熒光，然后這發(fā)出的熒光再通過濾光片分開，對應(yīng)的是不同的波長的濾光片，一般在fl1那的是530nm的濾光片，在FL2那的是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開了。
⒖MFI和GFI的意義？
Geo Mean，叫做幾何均數(shù)（geometric mean），常用于等級資料和對數(shù)正態(tài)分布資料，和常用的算數(shù)均數(shù)（mean）的計算方法不同。“ %total或者%gate的結(jié)果”代表的是百分率，即細胞占總體細胞或者是門內(nèi)細胞的百分比；用百分比作為統(tǒng)計指標，適用于熒光表達較強的指標。我看到你的流式圖上，檢測樣本的熒光強度不是很強，屬于弱表達的指標，若用百分率統(tǒng)計，就是會失去一部分弱陽性的數(shù)據(jù)。我建議可以用平均熒光強度（也就是mean值）作為統(tǒng)計指標，比較熒光強度的變化。
⒗流式技術(shù)中的APC，pure 標記是什么意思呢?
熒光物質(zhì)通常是指那些在受到一個波長激發(fā)后，處于一個能量不穩(wěn)定的狀態(tài)，能發(fā)射一個波長比激發(fā)波長長的光的一類物質(zhì)。當然熒光并不都是受激發(fā)后發(fā)射的，如一些生物可以發(fā)射熒光，如熒火蟲，發(fā)光細菌等，他們發(fā)出的光是通過體內(nèi)的酶促反應(yīng)而產(chǎn)生的，這個酶通常被稱為熒光素酶.EB是一種熒光物質(zhì)，它在受到紫外線照射后可以發(fā)出一可見光，常用于DNA、RNA電泳中。
APC英文全名：allophycocyanin；中文名：別藻青蛋白；大吸收峰：650nm，大發(fā)射熒光峰：660nm，適用于雙激光流式儀，可被600-640nm波長的激光激發(fā)。
PerCP英文全名：peridinin chlorophyll protein，中文名：多甲藻葉綠素蛋白；大激發(fā)波峰490nm，被488nm的氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光峰值約為677nm，與FITC、PE進行多色熒光染色補償重疊較少，非特異性結(jié)合也較少。雖然較易使用，但量子產(chǎn)量不高，多用于檢測表達較高的抗原。
⒘怎樣用流式細胞儀來鑒定小鼠BMDC？
檢測小鼠BMDC主要是從形態(tài)學和細胞表面分子兩方面來鑒定我做的時候就做了普通光鏡下形態(tài)、電鏡（掃描和透射），另外檢測了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86 、CD11、CD80。還做了MHC II類分子的檢測，還有MHCI類分子的檢測，這些分子在DC表面都不是特異存在的，在巨噬細胞、淋巴細胞表面也有表達，所以目前并沒有非常特異性的方法檢測你的細胞一定就是DC，但是從形態(tài)和表面分子的檢測結(jié)合來看，效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達水平較低，DC成熟過程中，上述分子表達呈上調(diào)趨勢，你可以在不同的培養(yǎng)時間分別檢測。
⒙血液里的mononuclear cell（除外紅細胞，血小板和破碎的細胞碎片），能不能用細胞大小來gating，只看我關(guān)心的細胞？
（1）紅細胞還是小一些，無法100%區(qū)分，但還是可用把大部分紅細胞gate掉。
（2）溶血也很重要，如果你的紅細胞多的話。（我猜不少，如果用ficol的話）?？梢杂寐然@溶液，如ACK（Lonzo），
（3）CD45是所有白細胞都表達的，可以用來區(qū)分RBC vs. WBC
⒚FCM檢測表達結(jié)果到底是用百分比還是MFI。
我作出是單峰，原本我覺得用MFI表示較好。但我做的2個蛋白很奇怪，一個表達率高，但MFI值低；另一個表達率低，但MFI值高。我又作了SYBR GREEN 定量PCR，發(fā)現(xiàn)mRNA 的表達基本與百分比相符，而與MFI值不太一致。
個人認為如果有明顯陰性細胞群和陽性細胞群，應(yīng)計算百分比；無明顯分群，僅熒光強度發(fā)生變化的應(yīng)該用MFI。如果是整體峰移（或者叫單峰），那么根本不存在MFI之外的任何合理的指標，不管MFI跟其它指標吻合度如何，這就是客觀數(shù)據(jù)、客觀事實。
⒛流式檢測胞內(nèi)抗原時打孔液的配方？
打孔液有很多種，方法也有很多。與你的實驗方法相關(guān)。我用過酒精固定或Triton X-100（我做的都是培養(yǎng)的細胞）：
（1）70%的酒精固定24小時即可，不再需要再打孔。如在PI染色測細胞周期或凋亡。
（2）Triton X-100是比較強烈的穿孔劑。0.1% Triton X-100/PBS（再加0.1%BSA） 是比較溫和一點。濃度可適當提高。作用時間以幾分鐘為宜。這個時間必須要自己試。時間長了細胞易破裂，短了則打孔不夠。如果你要染胞漿，則時間適當短些，如果要染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核內(nèi)等，由于要對兩層膜性結(jié)構(gòu)打孔，時間當然會長一些
（3）可以試試0.1% saponin（皂素）
21.標本必須在抗體染色后30分內(nèi)檢測嗎？
SOP是這么說的：
（1）Keep samples after staining covered with aluminum foil and at 4 0C （in the refrigerator） until they are run for flow analysis. The samples should be analyzed within 48 hours. Fluorescence loses its brightness if cells are not kept properly： not at 4 0C， or are exposed to light
（2）If cells are not fixed with paraformaldehyde， keep the samples on ice and run them immediately after staining is accomplished
因此，如果你沒有用PBS洗的話，可以用paraformaldehyde固定，放置48小時。洗了后應(yīng)該盡快檢測。如果做好不能及時檢測，我們一般是加入等量的2%的多聚甲醛固定，4度冰箱避光貯存。一般過夜沒有問題，第二天同樣PBS 2ml 洗滌細胞一次，上機檢測。
22.請問流式檢測膜蛋白表達的變化用多克隆抗體出結(jié)果的機會大嗎？
流式的抗體和WB的抗體是不同的（有部分可以通用），多抗一般是大的變性蛋白為抗原制備的，而WB的中被檢測蛋白就是變性狀態(tài)，所以很吻合，而流失中一般蛋白還是保持了天然構(gòu)象，所以產(chǎn)生的多抗可能不太好，而需要用很小特定的決定簇為抗原制備單克隆抗體。
23.在下近作人外周血流式，作表面及其胞內(nèi)染色，試劑說明書說要先分離外周血單個核細胞再染色，我有時候分的紅細胞比較多，其他的方法試過了，都改進的不好，我擔心紅細胞會有影響，想在分離出PBMC以后如果紅細胞比較多的話，就用紅細胞裂解液裂解一下，但是我有如下問題，希望這樣做過的同志指點一下，感激不禁。
（1）有人這樣在分離PBMC以后再裂解的嗎（我知道一般是在全血染色后再裂解紅細胞）？
（2）這樣會影響流式檢測嗎？
（3）用的裂解液配方是什么（自己用過的）。
（4）用法是什么｛我是在如果PBMC分出來以后要是紅細胞比較多的時候使用，這樣要怎樣把分出的PBMC稀釋，加多少裂解液 裂解多長時間，裂解后洗滌幾次等等｝。
我曾做骨髓液分離單個核細胞而后做流式，一般來說用Ficoll分過之后即便還有紅細胞殘留，上流式也可通過“設(shè)門”根據(jù)細胞形態(tài)大小將紅細胞剔除。若紅細胞殘留太多，則可通過紅細胞裂解液進一步去除之。我用的裂解液配方是：
碳酸氫鉀（KHCO3） 1.0g
氯化氨（NH4CL） 8.3g
EDTA-Na2 0.037g 加雙H2O至1000ml，為工作液。
配好后4度冰箱保存，使用時效果更好。我是在Ficoll分過之后用的，所以一般根據(jù)離心后EP管里細胞團的大小加紅細胞裂解液，通常5ml骨髓液分離單個核細胞后得到的細胞再加500ul裂解液，震蕩混勻置2－5分鐘紅細胞就基本上裂解干凈了。洗滌次數(shù)看白細胞多少而定，因為洗的次數(shù)越多，損失就越多。我一般洗一到兩次就OK了．做了很久沒發(fā)現(xiàn)這樣處理影響結(jié)果。有一點，我是在這樣處理后才標記抗體的，樓上的說是標記過才溶紅細胞，所以建議在溶的時候時間不宜過長，洗滌次數(shù)也不宜過多，以免將標記上的單抗洗脫。
24.表中流式細胞儀給出的平均值是什么意思，是怎樣得到的，有些文獻中提到“fluorescence per cell”，是下面的mean值嗎，還是要用mean值除以第1欄的細胞數(shù)events，才能得到fluorescence per cell ？
mean 值就是每個細胞的平均熒光強度，不用再除細胞數(shù)。這只是個相對值，如果求值，應(yīng)用已知熒光劑濃度值對應(yīng)儀器給出的mean值，做標準曲線。以后你得到的mean值，就可以根據(jù)這條標準曲線查出真正的熒光濃度值。
25.運用間接法流式細胞術(shù)，剛買了熒光二抗，是KPL的fluorescein-labeled affinity purified antibody to mouse IgG+IgM（H+L） produced in goat .說明說上提示要用TBS或是BSA或milk diluent/blocking solution液稀釋。稀釋至1：10～1：100。請問BSA是不是小牛血清，要用多少濃度的。TBS液我沒有，還有可否用注射用水稀釋。
BSA：牛血清白蛋白，濃度可以在一定范圍內(nèi)1%~5%，具體可參考其他抗體說明書。
TBS：Tris buffer saline。就是Tris的鹽溶液，很常規(guī)的溶液，配方：20mM Tris-HCl（ph8.0），150mM NaCl。
你說的注射用水應(yīng)該就是生理鹽水吧，這對抗體來說是不利的，雖然在基礎(chǔ)條件很差的情況下會用這個溶液，但是還不如PBS溶液。既然是做流式，按照正規(guī)程序操作抗體，得到的結(jié)果也能反映真實情況。
26.流式細胞檢測中怎樣把對照和樣本的檢測結(jié)果放在一張圖中？
分析獲取數(shù)據(jù)是分開進行的，不可以混在一起上樣。首先通過陰性對照調(diào)節(jié)基本電壓，固定條件后進行樣品檢測，分別保存結(jié)果。利用流式軟件的multigraph中的overlap可以將陰性對照和樣品結(jié)果相應(yīng)圖進行疊加，這只是獲取數(shù)據(jù)后對結(jié)果的組合和加工。