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實(shí)用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)手冊（中）
細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境
1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì) 細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受 其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響， 要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)原則一般是無菌 操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一 室。
2、常用設(shè)施及設(shè)備
（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。
（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作 臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及 消毒好的無菌物品等。
（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物
（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。
（5）分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。
3、培養(yǎng)器皿 常用細(xì)胞培養(yǎng)器皿有培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等。常準(zhǔn)備量是使用量的三倍。器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、利于細(xì)胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品 或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。
（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常用規(guī)格有 500 ml、250 ml、100 ml 等幾種。
（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì) 胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于
1 cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位，規(guī)格有 200 ml、100 ml、50 ml、25 ml、10 ml 等幾種。
（3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑 30 mm、60 mm、120 mm 等幾種。
（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有 球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用 1 ml 和 10 ml 兩種。短吸管也叫滴 管，分彎頭和直頭兩種。
（5）離心管：離心管是細(xì)胞培養(yǎng)中使用廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用 于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為 50 ml、
30 ml、15 ml；后者則多為 10 ml 和 5 ml。
（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。
4、細(xì)胞培養(yǎng)溫度
維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細(xì)胞對培養(yǎng)溫度要求也不同。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為 36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng)，溫度上升不超過 39℃ 時，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在 39-40℃1 小時，即能受到一定損傷，但仍有 可能恢復(fù)；在 40-41℃1 小時，細(xì)胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1 小 時，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在 43℃ 以上 1 小時，細(xì)胞全部死亡。相反，溫度不低于 0℃ 時，對細(xì)胞代謝雖有影響，但并無傷害作 用；把細(xì)胞放入 25－35℃ 時，細(xì)胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在 4℃ 數(shù)小時后，再回到 37℃ 培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長。細(xì)胞代謝隨溫度降低而減慢。當(dāng)溫度降至冰點(diǎn)以下時，細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。但是，如果向培養(yǎng)液中加入一定量的冷凍保護(hù)劑（二甲亞砜或甘油），可在深低溫下如－80℃ 或－196℃（液氮）長期保存。
5、合適的氣體環(huán)境
氣體是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧
氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長增殖的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。 開放培養(yǎng)時一般把細(xì)胞置于 95% 空氣加 5% 二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基
的 pH 值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜 pH 為 7.2-7.4，偏離這一范圍對細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。 但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長。但有一些細(xì)胞也喜歡偏 堿環(huán)境中生長，如成纖維細(xì)胞適合 pH 是 7.4-7.6。每種細(xì)胞都有其適 pH 值。
細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作基本技術(shù)
無菌操作技術(shù)分為三個部分：工作環(huán)境及表面的處理，細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理及培養(yǎng)液與培養(yǎng)細(xì)胞的處理。
工作環(huán)境的處理 使用層流超凈工作臺是經(jīng)濟(jì)有效的手段。超凈工作臺正常工作時，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進(jìn)入超凈臺。
（1）實(shí)驗(yàn)前，無菌室及無菌操作臺用紫外燈照射 30-60 分鐘滅菌，用 70% 酒精擦拭無菌 操作臺面，并開啟無菌操作臺風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn) 10 分鐘后，才可開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只 處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺。如需 要繼續(xù)進(jìn)行下一個實(shí)驗(yàn)，則用 70% 酒精擦拭無菌操作臺面，再讓無菌操作臺風(fēng)機(jī)運(yùn) 轉(zhuǎn) 10 分鐘后，才可進(jìn)行下一個實(shí)驗(yàn)操作。
（2）無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以 暫時放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完后應(yīng)及時移出，以利氣體流通。實(shí)驗(yàn)用品要用 70% 酒精 擦拭后才能帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺中央無菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣 非無菌區(qū)域操作。
（3）小心取出無菌實(shí)驗(yàn)用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要 在打開的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約 45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上。
（4）工作人員應(yīng)注意自身的安全，必須穿戴實(shí)驗(yàn)衣與手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人源性 或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心，并選擇適當(dāng)?shù)燃壍臒o菌操作臺（至少兩級）。操作過 程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑，例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖 銳物品傷人等。
（5）定期檢查下列項(xiàng)目：CO2 鋼瓶內(nèi)的 CO2 壓力；CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)的 CO2 濃度、溫度、及水盤 是否有污染；無菌操作臺內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及 HEPA 過濾器濾膜， 預(yù)濾網(wǎng) ﹙300 小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA）。
培養(yǎng)細(xì)胞生長過程：潛伏期→指數(shù)增生期→停滯期
潛伏期 (latent phase)
細(xì)胞接種后, 先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期. 此時, 細(xì)胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形. 然后細(xì)胞貼附于載體表面, 稱貼壁, 懸浮期結(jié)束. 細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類, 培養(yǎng)基 成分, 載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢, 可達(dá) 10-24 小時或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常 10-30 分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過一個潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期. 原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約 24-96 小時或更長, 連續(xù) 細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅需 6-24 小時。
(2) 指數(shù)增生期 (logarithmic growth phase)
這是細(xì)胞增殖旺盛的階段，分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為 判定細(xì)胞生長是否旺盛的一個重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI）表 示，即細(xì)胞群中每 1000 個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于 0.1%-0.5%，原 代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá) 3％－5％。指數(shù)增生期 的細(xì)胞活力時期，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)時期，也是凍存細(xì)胞的時機(jī)。在接種細(xì) 胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù) 3－5 天后，隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少， 后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱接觸抑 制現(xiàn)象 (contact inhibition)。而惡性腫瘤細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致 細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接 觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng) 細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)枯竭和代 謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。
（3）停滯期 (Stagnate phase)
細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時進(jìn)行傳代，細(xì)胞就會停止增殖，進(jìn)入停止期。此時 細(xì)胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如 不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出 現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會脫落，嚴(yán)重的會發(fā)生死亡，因此，應(yīng)及時傳代。
培養(yǎng)細(xì)胞基本形態(tài)
培養(yǎng)細(xì)胞隨貼附支持物形狀不同而形態(tài)各異，常見的是貼附于平面支持物細(xì)胞。在一般光鏡下生存中的細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不明顯。細(xì)胞在生長期常有 1-2 個核仁。在細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良時，細(xì)胞輪廓會增強(qiáng)，反差增大。若胞質(zhì)中時而出現(xiàn)顆粒、脫滴和腔 泡等，表明細(xì)胞代謝不良。
體外培養(yǎng)細(xì)胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生 長和懸浮型生長兩大類。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時能貼附在支持物表面生長。如羊水細(xì)胞為貼 附型細(xì)胞，常表現(xiàn)為成纖維型細(xì)胞和上皮細(xì)胞生長。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長。
（1）成纖維型細(xì)胞 在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時，皆可稱之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長，細(xì)胞中央有卵園形核，胞質(zhì)向外伸出 2-3 厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細(xì)胞外， 凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類形態(tài)生長。
（2）上皮型細(xì)胞 此類型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長具有扁平不規(guī)則多角形特征，細(xì)胞中央有園形核，細(xì)胞緊密相連單層膜樣生長。起源于內(nèi)、外胚層細(xì)胞如皮膚、表皮衍生物、消化管上皮等組織細(xì)胞培養(yǎng)時，皆呈上皮型形態(tài)生長。
（3）游走型細(xì)胞 本型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)膩包形態(tài)。常 見于羊水細(xì)胞培養(yǎng)的早期。