實驗背景

細胞三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生速率是一種描述細胞代謝的信息含量很高的測量，因為

ATP是細胞內(nèi)普遍存在的主要能量貨幣。細胞的代謝調(diào)控使細胞根據(jù)ATP需求的變化調(diào)整ATP產(chǎn)生的變化來維持總的細胞內(nèi)的ATP水平。

  安捷倫Seahorse XF實時ATP速率測定被設(shè)計用來測量活細胞總的ATP產(chǎn)生速率。更重要的是，這個實驗?zāi)軌騾^(qū)分哺乳動物細胞內(nèi)兩條主要的產(chǎn)生ATP的代謝途徑線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解ATP的產(chǎn)生。

     Seahorse XF實時ATP速率測定利用代謝的調(diào)節(jié)劑（寡霉素（Oligomycin），魚藤酮（Rotenone）及kang霉素A（Antimycin A）的混合物，見圖1），當連續(xù)加藥后，可以計算線粒體和糖酵解的ATP產(chǎn)生速率。配合Seahorse XFe24，XF96或XFe96分析儀，SeahorseXF實時ATP速率測定通過提供細胞ATP產(chǎn)生速率的實時測量和細胞能量平衡的定量表型為細胞生物能量學提供了一個新的動態(tài)和定量的視角。

圖1. 安捷倫Seahorse XF實時ATP速率測定方案-OCR和ECAR測量的動力學曲線。   首先測量基礎(chǔ)OCR和ECAR。加入寡霉素導(dǎo)致線粒體ATP合成受到抑制從而引起OCR減少，使mitoATP產(chǎn)生速率得以量化。ECAR數(shù)據(jù)結(jié)合檢測液的緩沖系數(shù)可以計算總的質(zhì)子流出速率（PER）。用魚藤酮和kang霉素A*抑制線粒體呼吸能夠計算線粒體相關(guān)的酸化，結(jié)合PER數(shù)據(jù)能夠計算glycoATP產(chǎn)生速率。

   哺乳動物細胞中，糖酵解和氧化磷酸化（OXOHOS）途徑提供大部分的細胞ATP。氧化磷酸化消耗O2，驅(qū)動氧氣消耗速率（OCR），這兩條途徑都能導(dǎo)致檢測液酸化。葡萄糖通過糖酵解轉(zhuǎn)換成乳酸，每分子乳酸伴隨著一個H+流出，而TCA循環(huán)使ETC/氧化磷酸化產(chǎn)生CO2，也會導(dǎo)致檢測液酸化。這些反應(yīng)的總和是細胞外酸化（ECAR）變化的主要驅(qū)動因素。

詞匯表

· glycoATP產(chǎn)生速率(glycoATPProduction Rate)：糖酵解途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)變成乳酸相關(guān)的ATP產(chǎn)生速率(以pmol ATP/min來表示)。

· mitoATP產(chǎn)生速率(mitoATPProduction Rate)：線粒體氧化磷酸化相關(guān)的ATP產(chǎn)生速率(以pmol ATP/min來表示)。

· 總的ATP產(chǎn)生速率(Total ATP Production Rate)：活細胞在適當?shù)膶嶒灄l件下線粒體ATP產(chǎn)生速率和糖酵解ATP產(chǎn)生速率之和。

· P/O值(P/O ratio)：一對電子通過線粒體電子傳遞鏈每還原一個氧原子(O)合成的ATP分子數(shù)(即磷酸化為ATP的ADP摩爾)。

· XF ATP速率指數(shù)(XF ATPRate Index)：在一定時間點，mitoATP產(chǎn)生速率除以glycoATP的比值。這是一個有價值的檢測代謝表型變化和/或差異的指標。XF ATP速率指數(shù)的增加表示更多的氧化/更少的糖酵解表型，反之亦然。

· 誘導(dǎo)實驗(Induced Assay)：XF實時ATP速率測定工作流程包含一次在連續(xù)注射寡霉素和魚藤酮/kang霉素A之前的實驗化合物急性注射。此工作流程能夠測量ATP產(chǎn)生的原位激活或抑制，以及XF ATP速率指數(shù)(mitoATP產(chǎn)生速率/glycoATP產(chǎn)生速率)的實時改變。

· 緩沖系數(shù)(Buffer Factor)：測量系統(tǒng)的緩沖能力，包括檢測液和XF實驗條件(儀器，探針，實驗耗材)。

· 糖酵解(Glycolysis)：在Seahorse XF實驗中，由葡萄糖轉(zhuǎn)變成乳酸的過程。

· 質(zhì)子流出速率(Proton Efflux Rate)：隨著時間的推移，細胞排出到檢測液中的質(zhì)子數(shù)，以pmol/min來表示。

· 糖酵解質(zhì)子流出速率(Glycolytic Proton Efflux Rate)：來源于糖酵解的質(zhì)子流出速率(扣除CO₂依賴的酸化的影響)。這個測量指標與細胞外乳酸的產(chǎn)生速率高度相關(guān)。

· ATP偶聯(lián)的呼吸(ATP coupled respiration)：基礎(chǔ)呼吸中被用來驅(qū)動ATP產(chǎn)生的部分。通過注射ATP合酶抑制劑寡霉素進行定量。

 常見問題

§ 如果檢測液中含有不同的氧化底物（不同的P/O值），mitoATP產(chǎn)生速率如何計算？

    為了將ATP偶聯(lián)的呼吸轉(zhuǎn)換為線粒體的ATP產(chǎn)生速率，在電子傳遞鏈末端每還原一個氧原子，ADP磷酸化為ATP的化學計量學必須得到確定。不同的底物理論上大的P/O值不同，并且依賴于化學計量學/底物氧化通路，以及F₁F₀ ATP合酶的效率。在標準的XF實驗條件下，細胞被供給底物混合物（主要是葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺），且通常內(nèi)源性底物儲備（糖原，脂肪酸，其他氨基酸）可用于線粒體氧化。因此，用幾種細胞系進行了測試并確認P/O值2.75準確代表了外源性和內(nèi)外源性氧化底物混合物的平均P/O值。

當進行誘導(dǎo)的XF實時ATP速率測定時，誘導(dǎo)的速率是如何計算和報告的？

     在XF實時ATP速率誘導(dǎo)實驗中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations顯示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之間所有測量的平均值計算的。然而，每個時間點的誘導(dǎo)速率可以從Kinetic Rate Data（Measure Sheet）中獲得。

§ XF實時ATP速率測定中定義的XF ATP速率指數(shù)是什么？

    XF ATP速率指數(shù)是mitoATP產(chǎn)生速率與glycoATP產(chǎn)生速率的比值（即mitoATP rate/glycoATP rate）。這個比值是一個細胞代謝表型的定量指標。代謝指數(shù)大于1代表大于50%的細胞ATP來自線粒體的ETC/氧化磷酸化，而指數(shù)小于1表示大于50%的總ATP是糖酵解途徑產(chǎn)生的。因為代謝指數(shù)是比值測量，所以它對于代謝表型的改變或轉(zhuǎn)換是高度敏感的。

§ 為什么相同的細胞類型當細胞以不同的密度種板時XF ATP速率不一樣？

    細胞的代謝表型會被細胞對ATP的需求所影響。一般來說，處于增殖或分化中的細胞比融合（緩慢生長）或末端分化的細胞擁有更高的糖酵解速率。為了比較實驗之間的結(jié)果，推薦在整個研究過程中保持一致的細胞培養(yǎng)條件和細胞接種密度。

§ 為什么必須用Seahorse XF DMEM培養(yǎng)基，pH 7.4或Seahorse XF RPMI培養(yǎng)基，pH 7.4來進行這個實驗？

       GlycoATP產(chǎn)生速率的計算需要對XF實時ATP速率測定中的糖酵解質(zhì)子流出速率進行測量。為了正確計算PER，檢測液必須要有一個固定的緩沖能力。培養(yǎng)基中低濃度的HEPES 在實驗的時間范圍內(nèi)提供了一致的緩沖能力值。雖然添加HEPES緩沖液輕微地減少了ECAR信號，但是它顯著提高了ECAR數(shù)據(jù)的質(zhì)量和一致性，以及轉(zhuǎn)換為PER的準確性（更多詳情，請參閱White paper: Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology）。此外，使用預(yù)調(diào)pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培養(yǎng)基節(jié)省了實驗準備的時間，確保XF實驗過程中一致的檢測液pH值。

§ 我能夠使用其他的Seahorse XF檢測液來運行XF實時ATP速率測定嗎？

   GlycoATP產(chǎn)生速率的準確計算需要使用一種沒有酚紅和碳酸氫鈉且低濃度HEPES緩沖液的檢測液。因此，強烈推薦使用安捷倫Seahorse XF DMEM（或RPMI），pH 7.4的培養(yǎng)基。任何偏離推薦的培養(yǎng)基和補充劑（葡萄糖，丙酮酸鈉，谷氨酰胺），需要根據(jù)經(jīng)驗（使用XF分析儀）確定每個實驗的緩沖系數(shù)（參閱Seahorse XF Buffer Factor Protocol以進一步了解信息）。任何含有酚紅的檢測液不能在XF實時ATP速率測定中使用。

§ 當運行誘導(dǎo)的XF實時ATP速率測定時，寡霉素注射之后的OCR高于基礎(chǔ)OCR，發(fā)生了什么？

     在寡霉素注射之前加入的化合物使電子傳遞與氧化磷酸化解偶聯(lián)（如FCCP，DNP等等），通常會導(dǎo)致OCR增加。然而，這種呼吸不與ATP的產(chǎn)生偶聯(lián)，因為沒有ATP合酶的參與，線粒體膜電位會減少或消除，所以在這種環(huán)境下很少或沒有ATP生成。在這些情況下，基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率不能夠被準確計算。如果懷疑存在解偶聯(lián)化合物，那么推薦添加一組對照組，注射檢測液+溶劑來計算基礎(chǔ)的mitoATP產(chǎn)生速率。