詳細介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
登革熱病毒1型(DFV-I)核酸檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2:調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保7min。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4:PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
下列相關(guān)產(chǎn)品:
小鼠脫氫表雄酮(DHEA)PCR檢測試劑盒 ,英文名: DHEA
小鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)ELISA檢測試劑盒MouseInsulin-likegrowthfactor1,IGF-1ELISAKit 50T
人胱天8(Casp-8)免疫試劑盒 Human Caspase 8,Casp-8
RatE-SelectinELISAKit大鼠E選擇素(E-Selectin/CD62E)PCR檢測試劑盒
5摩爾硫代(SodiumThiosulfate)100毫升
MouseFreeTestotero
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性定量方法,已得到,廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,再加入抗di高辛酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
小鼠固酮(ALD)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
Human urokinase type plasminogen activator (uPA) ELISA Kit 人型纖溶酶原激活物(uPA)ELISA試劑盒
Humanbasicfetoprotein,BFPELISAKit 人堿性胎兒蛋白(BFP)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
Guineapigmajorhistocompatibilitycomplex,MHC/GPLAELISA試劑盒豚鼠主要組織相容性復合體(MHC/GPLA)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
真菌/酵母細胞活性線粒體分離試劑盒10次
Mousebrain-gpeptides,BGP/GehrelinELISAKit小鼠腦腸肽(BGP/Gehrelin)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
小鼠顆粒酶A(GZMA)ELISA試劑盒 ,英文名: GZMA ELISA Kit
人芳香烴受體(AhR)ELISA檢測試劑盒Humanarylhydrocarboeceptor,AhRELISAKit 96T/48T
大鼠血清淀粉樣蛋白A(SAA)免疫試劑盒 Rat Serum amyloid A,SAA ELISA Kit
英文名稱RatLPSELISAKit大鼠脂多糖(LPS)規(guī)格:96T/48T
高多糖多酚植物組織葉綠體DNA萃取試劑盒10/20次
ELISAKitfPSA人游離前列腺特異性抗原規(guī)格:48T/96T
登革熱病毒1型(DFV-I)核酸檢測試劑盒Anti-PAK2 /FITC 熒光素標記p21激活2抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Goat Anti-rabbit IgG 羊抗兔IgG (親和層析化)Multi-class antibodies規(guī)格: 1mg
抗g-氨基B1受體抗體 anti-GABAB1 0.2ml
Goat Anti-rabbit IgG/Alexa Fluor 555 Alexa Fluor 555標記的羊抗兔IgG 0.1ml
FLNB 英文名稱: 細絲蛋白3抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-SRC-3 (Thr24) 0酸化類固醇受體輔助活化因子-3 規(guī)格 0.1ml
Goat Anti-rabbit IgG 羊抗兔IgG (親和層析化)Multi-class antibodies規(guī)格: 1mg
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
3.樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。