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詳細(xì)介紹
實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性定量方法，已得到，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽(yáng)性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測(cè)序——>測(cè)序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫(kù)——>質(zhì)粒實(shí)物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
豬肺炎支原體PCR檢測(cè)試劑盒 | PCR檢測(cè)試劑盒 | 50T |
下列相關(guān)產(chǎn)品：
小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子D(VEGF-D)PCR檢測(cè)試劑盒 50T
Rat calcineurin (CaN) 大鼠鈣調(diào)0酸酶(CaN)PCR檢測(cè)試劑盒
HumanUreaplasmaurealyticumaibody,UU-AbELISAKit 人解脲脲原體抗體(UU-Ab)PCR檢測(cè)試劑盒 50T 進(jìn)口分裝
BovineacetonePCR檢測(cè)試劑盒牛同檢測(cè)(acetone)PCR檢測(cè)試劑盒
A含量熒光定量檢測(cè)試劑盒20次
MouseInsulin-likegrowthfactor2,IGF
PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針?lè)晒舛?span>PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4：PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
定量PCR方法：
a、競(jìng)爭(zhēng)法 產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
大鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)ELISA試劑盒 ，英文名： IGF1 ELISA Kit
Mouse brain derived neuroophic factor (BDNF) ELISA Kit 小鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)ELISA試劑盒
Mouseierleukin8,IL-8ELISAKit 小鼠白介素8(IL-8/CXCL8)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
CLIAKitforHumanCoisolELISAKit人唾液規(guī)格：48T/96T
細(xì)胞BLK活性定量檢測(cè)試劑盒(A/B/C)20次
ELISAKitBMPR-1A大鼠骨成型蛋白受體1A規(guī)格：48T/96T
小鼠凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(LOX-1)ELISA試劑盒 ，英文名： LOX-1 ELISA Kit
雞層連蛋白/板層素(LN)ELISA檢測(cè)試劑盒ChickenLaminin,LNELISAKit 96T/48T
人5羥色胺/血清素/血清胺(5HT/ST)抗體(IgA)免疫試劑盒 Human 5HT IgA ELISA Kit
英文名稱MouseGamma-aminobyricacidELISAKit小鼠γ氨基(GABA)規(guī)格：96T/48T
冰凍切片組織CDK4蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒10/20次
RatCollageypeⅣ,ColⅣELISA試劑盒大鼠Ⅳ型膠原(ColⅣ)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
豬肺炎支原體PCR檢測(cè)試劑盒Anti-TEM 1/CD248/FITC 熒光素標(biāo)記內(nèi)涎蛋白/內(nèi)皮唾液酸蛋白抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
p-Arhgef2/GEF-H1(Rho guanine nucleotide exchange factor 2,pSer810) 0酸化Rho鳥(niǎo)苷酸交換因子2抗原Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
蛋白酪0酸酶2抗體 Anti-SHP2/PTPN11 0.2ml
phospho-STAT1 (Tyr701) 英文名稱： 0酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1抗體 0.1ml
eIF2C2 英文名稱： 真核翻譯起始因子2C2抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh phospho-M-CSF Receptor(Tyr546) 0酸化巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體抗體 規(guī)格 0.1ml
p-Arhgef2/GEF-H1(Rho guanine nucleotide exchange factor 2,pSer810) 0酸化Rho鳥(niǎo)苷酸交換因子2抗原Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
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