詳細介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
解脲支原體PCR檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2:調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保7min。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4:PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl進行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
下列相關(guān)產(chǎn)品:
黏孢子蟲屬通用PCR檢測試劑盒 Myxosporidia spp.PCR
捻轉(zhuǎn)血矛線蟲PCR檢測試劑盒 Haemonchus contortusPCR
鳥分枝桿菌PCR檢測試劑盒 Mycobacterium aviumPCR
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性定量方法,已得到,廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,再加入抗di高辛酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
大鼠白細胞介素1β(IL-1B)ELISA試劑盒 ,英文名: IL-1B ELISA Kit
Mouse macrophage inflammatory protein 3 beta (MIP-3 beta /ELC/CCL19) ELISA Kit 小鼠巨噬細胞炎性蛋白3β(MIP-3β/ELC/CCL19)ELISA試劑盒
MouseBromodeoxyuridine,BrdUELISAKit 小鼠溴脫氧核苷尿(BrdU)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
CLIAKitforHumanomeinELISAKit人網(wǎng)膜素規(guī)格:48T/96T
同位素核酸-蛋白結(jié)合凝膠電泳定量分析(McKay)試劑盒20次
ELISAKitsVCAM-1大鼠可溶性血管細胞粘附分子1規(guī)格:48T/96T
小鼠髓分化因子88(MyD88)ELISA試劑盒 ,英文名: MyD88 ELISA Kit
豚鼠免疫球蛋白E(IgE)ELISA檢測試劑盒guineapigImmunoglobulinE,IgEELISAKit 96T/48T
牛結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白(Hpt/HP)免疫試劑盒 Bovine Haptoglobin,Hpt/HP ELISA KIT
英文名稱HumanBonemorphogeneticprotein7ELISAKit人骨成型蛋白質(zhì)7(BMP-7)規(guī)格:96T/48T
動物細胞/組織亮氨基肽酶(leucineaminopeptidase;LAP)電泳分析試劑盒5次
RatsolubleendothelialproteinCreceptor,sEPCRELISA試劑盒大鼠可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體(sEPCR)酶聯(lián)免疫分析大鼠可溶性血管內(nèi)皮細胞蛋白C受體(sEPCR)酶聯(lián)免疫分析體(sEPCR)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
解脲支原體PCR檢測試劑盒Anti-SARS S-protein/FITC 熒光素標記非典病毒表面蛋白S抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
ShK(Stichodactyla helianthus Neurotoxin)-(Gln9) ??窠?jīng)毒素(35肽)Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1mg
基質(zhì)金屬-7抗體 Anti-MMP-7 0.1ml
alpha-Synuclein (NT) 英文名稱: 核突觸蛋白-α抗體(N端) 0.1ml
FGF10 英文名稱: 成纖維細胞生長因子10抗體 0.1ml
Rhesus antibody Rh Phospho-PDGFRA(Tyr849)/PDGFRB(Tyr857) 0酸化血小板源性生長因子受體α/β抗體 規(guī)格 0.1ml
ShK(Stichodactyla helianthus Neurotoxin)-(Gln9) ??窠?jīng)毒素(35肽)Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1mg
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
3.樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。