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一、簡(jiǎn)介

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒是基于抗體和蛋白的特異性親和作用，通過捕獲與蛋白或抗原特異性結(jié)合的抗體，進(jìn)而從復(fù)雜的樣品中捕獲及富集目標(biāo)蛋白，同時(shí)可以測(cè)定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子。

實(shí)驗(yàn)前：為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所有的步驟均需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化。
例如：根據(jù)細(xì)胞系或被捕獲的抗原后續(xù)用途的不同可選擇更加合適的細(xì)胞裂解條件。對(duì)于沒有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以直接使用去污劑進(jìn)行裂解，但其它細(xì)胞，則需要一些機(jī)械剪切力輔助，例如超聲破碎。以下列出的（包括裂解液、孵育時(shí)間、體積及濃度）是作為初始嘗試的條件建議，zui終的優(yōu)化需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。

另外，細(xì)胞裂解物在進(jìn)行免疫(共)沉淀前，可*行蛋白免疫印跡法檢測(cè)，以此來確定細(xì)胞裂解物里存在目標(biāo)蛋白。

二、試劑盒組分

注： Lysis buffer 使用前，立刻加入 1 mM PMSF（推薦購(gòu)買abs42025063，自行配制）。

三、使用方法

A. 制備細(xì)胞裂解物
1. 吸干培養(yǎng)基。添加含有調(diào)節(jié)分子的新鮮培養(yǎng)基，使其在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。
2. 收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)基后用冰預(yù)冷的 1X PBS 洗滌細(xì)胞一次。
3. 去除 PBS 并在每個(gè)細(xì)胞板上 (10 cm) 加入 0.5 ml 冰預(yù)冷的 Lysis buffer，并在冰上孵育至少 5分鐘。
4. 從板上刮下細(xì)胞，把提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管。置于冰上。
5. 在冰上進(jìn)行 3 次超聲破碎，每次 5 秒。
6. 在 4°C，在 14,000 x g 條件下，微量離心 10 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新管中。上清液即為細(xì)胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。
注：細(xì)胞裂解物制備好之后，可*行蛋白免疫印跡法檢測(cè)，以此來確定細(xì)胞裂解物里存在目標(biāo)蛋白。

B. 免疫沉淀法
細(xì)胞裂解物預(yù)清除（可選步驟）
1. 向 500μl（含總蛋白 200-1000ug） 細(xì)胞裂解物中添加 5μl Protein A 和 5μl Protein G。
2. 在 4°C 下，旋轉(zhuǎn)孵育 30-60 分鐘。
3. 4°C 條件下 12000g 離心 1min，保留上清，待用。
抗原抗體結(jié)合
1. 在新的離心管內(nèi)加入500μl（含總蛋白200-1000ug）細(xì)胞裂解物（可以是預(yù)清洗后的細(xì)胞裂解物）。
2. 加入目標(biāo)蛋白的單克隆/多克隆抗體（1-5μg），
3. 同時(shí)采用非特異免疫的同源抗體作為對(duì)照。
4. 在 4℃輕柔混合過夜。
免疫復(fù)合物沉淀
1. 抗體孵育過夜后，加入5μl Protein A和5μl Protein G。
2. 在4℃溫和地混勻1-3小時(shí)或過夜。
3. 12000g離心1min，保留沉淀。
4. 使用0.5ml 1*Wash buffer清洗沉淀，12000g離心1min，保留沉淀。
5. 重復(fù)第4步，共計(jì)清洗3次。
注：清洗，去上清的時(shí)候需要注意避免吸走填料

C. 用蛋白免疫印跡法進(jìn)行分析
1. 在 20-40 µl 1* SDS 樣品緩沖液中重懸沉淀物。渦旋振蕩，然后再微量離心 30 秒。
2. 將樣品加熱至 95–100°C 并持續(xù) 2-5 分鐘，然后在 14,000 x g 下瞬時(shí)離心 1 分鐘。
3. 將樣品 (15-30 µl) 上樣到 SDS-PAGE 凝膠上。
4. 用蛋白質(zhì)印跡法分析樣品。

四、試劑盒保存方法

本試劑盒4℃保存，1年有效。